調節性T細胞在腫瘤放療聯合免疫治療中的研究進展

郭茹玥，韓高華

1大連醫科大學研究生院，遼寧大連116044

2泰州市人民醫院腫瘤科，江蘇泰州225300

放療是治療惡性腫瘤最常用的一種手段，主要是通過直接輻射誘導腫瘤細胞凋亡，對腫瘤患者生存率的影響通常表現為局部控制腫瘤，減少全身轉移。研究發現，放療除了直接損傷腫瘤細胞外，還可改變腫瘤微環境，誘導具有治療意義的抗腫瘤免疫反應，同時也激活了免疫抑制途徑，腫瘤放療后的療效與免疫網絡密切相關。輻射腫瘤微環境可觀察到多層次調控，包括腫瘤血管系統損傷、免疫微環境改變、調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）浸潤增多等。在各種類型的腫瘤中，Treg細胞的高浸潤與低生存率有關，可使多種免疫細胞失活、凋亡，為腫瘤細胞的生長浸潤提供庇護所。因此，需要尋找最佳的治療方法減少Treg細胞或減弱其在腫瘤組織中的抑制活性，同時激活腫瘤特異性效應T細胞，提高放療的抗腫瘤免疫反應。

1 Treg的概述

Treg細胞是一類抑制性T細胞的功能亞群，最早追溯到1970年就有研究者提出抑制性T細胞這一概念，1980年有學者在小鼠模型中證實了該細胞具有免疫抑制的作用，1995年Sakaguchi等正式確認其作用并發表報道。目前許多不同類型的Treg細胞已被鑒定，最突出的類型是自然發生在胸腺的Treg（natural Treg，nTreg）和外周誘導型Treg（induced Treg，iTreg）。

胸腺T細胞在成熟階段開始表達T細胞受體（T cell receptor，TCR）序列，通過陽性和陰性的選擇產生有功能的T細胞識別外來抗原發揮其免疫功能。陽性選擇的目的是使那些表達TCR識別自身（或宿主）主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子的T細胞存活下來，陰性選擇主要導致與自身MHC-抗原肽親和力高的T細胞被排除。然而，一些具有自身反應性TCR的T細胞在與具有高親和力的自身抗原肽相互作用后可以發育成Treg。這種自然發育的Treg占外周CD4T細胞群的5%～10%，并以CD25的高表達和CD45RB亞型的低表達水平為特征，在維持自我免疫耐受和調節免疫反應中發揮著重要作用。iTreg主要來源于外周免疫系統中的CD4T細胞，其形成較為復雜，決定iTreg細胞發育的關鍵因素包括抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC）的類型、分化狀態以及激活過程中的細胞因子環境。腫瘤浸潤性樹突狀細胞在分化的未成熟階段被阻斷并具有耐受性，可以刺激Treg細胞分化，轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、吲哚胺-2，3-雙加氧酶-1（indoleamine 2,3-dioxy-genase 1，IDO-1）等也可明顯促進CD4T細胞向Treg細胞分化。

2 Treg介導的免疫抑制

Treg細胞是外周對自身和非自身抗原耐受的重要介質，通過多種抑制機制實現這種免疫調節控制。①細胞接觸依賴機制：Treg細胞表面可表達特異性蛋白分子——叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）、細胞毒T淋巴細胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）、TGF-β、糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）等。FOXP3是Treg細胞產生、維持免疫抑制功能的主要調控基因，在原始T細胞中表達FOXP3可導致機體發生免疫抑制。研究發現，具有FOXP3基因移碼突變的小鼠由于缺乏Treg細胞可使效應T細胞活化增加，轉染FOXP3的CD4CD25原始T細胞可轉化為CD4CD25Treg細胞，產生抑制性細胞因子并表達主要的Treg細胞表面分子，如CD25、CTLA-4、TGF-β、GITR等，這些分子的具體免疫抑制機制將于下文提到。②分泌抑制性細胞因子：Treg細胞通過分泌包括TGF-β、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和白細胞介素-35（interleukin-35，IL-35）等抑制性細胞因子顯示其抑制活性。TGF-β、IL-10主要通過抑制樹突狀細胞和效應CD8T細胞的功能并促進CD4T細胞轉化為Treg細胞發揮作用；IL-10可影響巨噬細胞的分化削弱其殺死腫瘤細胞的能力，其受體缺失的Treg細胞無法維持FOXP3的表達；IL-35是Treg細胞分泌的一種新型免疫抑制分子，在進入組織后通過“感染耐受”使接觸到的非Treg細胞具備抑制其他細胞的能力。③腫瘤微環境中特定代謝產物如IDO-1、腺苷的局部積累可抑制效應T細胞，促進Treg細胞增殖。腫瘤細胞糖酵解代謝的加速導致葡萄糖的消耗和脂肪酸的增加，脂肪酸代謝促進Treg的發育。④Treg細胞通過分泌穿孔素、顆粒酶A/B等對B細胞、自然殺傷T細胞（natural killer T cell，NKT）產生抑制作用，此外Treg細胞還能抑制Ⅱ型固有淋巴細胞、NKT細胞、肥大細胞、嗜堿性細胞和嗜酸性細胞的激活。

3 放療對Treg的影響

作為臨床上常用的一種治療方法，放療主要通過直接殺傷腫瘤細胞、阻斷腫瘤血管再生及改變腫瘤免疫微環境等發揮其對惡性腫瘤的殺傷效應，后者表現為射線殺傷腫瘤細胞以后釋放抗原物質進入腫瘤微環境中，激活樹突狀細胞并加強APC的呈遞，動員抗腫瘤免疫細胞前往腫瘤組織發揮腫瘤特異性免疫反應。然而放療在激活抗腫瘤免疫的同時，也可產生免疫抑制作用，這種作用可能與放療引起Treg細胞增加、腫瘤細胞表面程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）上調、骨髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）浸潤、樹突狀細胞功能受損等有關。放療對Treg的影響是多方面的。①放療引起Treg細胞數量改變：放療可使所有T細胞增殖，其中Treg細胞最為顯著。Anderson等首先發現，放療可致Treg細胞增多，且這部分細胞在放療后仍具有免疫調節功能。Muroyama等進一步發現放療后Treg細胞的Ki-67染色增加了自身增殖，明顯使腫瘤微環境中的Treg細胞增多，且CTLA-4、CD137和轉錄因子Helios的表達均高于非放射腫瘤。②放療劑量對Treg細胞的影響：一項數據顯示，單劑量或分次劑量2 Gy的局部放療可導致脾臟內Treg細胞增加，將劑量增加到20 Gy可使腫瘤浸潤Treg細胞的比例增加一倍。然而也有一些學者發現，隨著照射劑量的增加Treg細胞呈劑量依賴性凋亡，許多因素可能導致這些研究的不同結果，如輻射劑量的差異、放療后的評估時間、局部照射與全身照射的差異以及腫瘤與非腫瘤模型的差異。雖然已經有許多研究表明放療可使Treg細胞數量增多，但不同劑量對其數量變化的影響目前仍有爭議。③放療對Treg細胞表型和功能產生影響：Cao等發現γ射線輻射后Treg細胞上CD62L、FOXP3、CD45RO、TGF-β表達降低，GITR及凋亡相關基因B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白（B cell lymphoma/leukemia-2-associated X protein，BAX）表達增強，這些表型通過劑量依賴型減弱了Treg細胞對自身T細胞的抑制能力并誘導了自身凋亡。Beauford等進一步發現放療以劑量依賴的方式下調了Treg細胞上的FOXP3、CD25和CTLA-4表達，誘導淋巴細胞激活基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG3）的表達升高，使其抑制CD8T細胞增殖的能力減弱。這兩個實驗證明了放療可能通過改變Treg細胞的表型影響其抑制功能，且這種改變與照射劑量及分割模式有關。

4 Treg細胞對放療療效的影響

Treg細胞是免疫系統的重要組成部分，與傳統放療的相互作用可能從根本上影響腫瘤治療的療效。淋巴細胞是放射敏感性最高的細胞，其次是單核細胞、巨噬細胞和APC。即使淋巴細胞是對電離輻射特別敏感的細胞，但單個淋巴細胞亞群的輻射敏感性存在很大的差異，Treg細胞比其他T淋巴細胞或B淋巴細胞亞群更具抗輻射性，其抗輻射作用部分是由促凋亡蛋白下調和抗凋亡蛋白上調介導的，TGF-β存在于腫瘤微環境中也可能有助于腫瘤內T細胞的放射抗性。在腫瘤環境中，Treg細胞與放療療效呈負相關，一方面放療促進了Treg的分化與增殖，另一方面Treg通過其抗輻射及抗腫瘤免疫抑制作用，使腫瘤細胞逃避免疫殺傷，影響放療的療效。

5 放療聯合Treg相關免疫治療的研究進展

基于上文所述，單純放療所誘發的免疫增強作用是很弱的，并不足以抗衡放療誘導Treg的免疫抑制作用，總體上放療對Treg細胞的分化、增殖起到促進作用，誘導了免疫抑制，影響放療的療效。隨著靶向免疫治療日益增多，放療聯合免疫治療引起越來越多的關注，Treg細胞已成為當前聯合治療的重要靶點。

5.1 抗CTLA- 4單抗聯合放療

CTLA-4是目前研究最多、臨床應用最廣泛的一個靶點，是Treg細胞表面的抑制性受體。盡管Treg細胞可通過多種途徑抑制體內免疫功能，并且每種途徑可能因環境和免疫環境的不同而不同，但是在CTLA-4介導的途徑存在缺陷的情況下，即使其他抑制機制更加活躍以彌補該缺陷，Treg也難以維持其自身耐受和免疫穩態。因此，CTLA-4是T細胞應答的一個重要的負調控因子，并且是在生理和病理免疫反應（包括自身免疫、過敏和腫瘤免疫）中控制Treg抑制功能的關鍵分子靶點。CTLA-4與B7分子結合可截斷B7/CD28通路，此通路是T細胞活化的重要一環，該通路被阻斷可使T細胞無法被激活，處于免疫應答失活狀態。放療可上調APC表面的B7-1，由于Treg細胞表面的CTLA-4與B7-1的親和力更高，導致放療后更多的表現為免疫抑制。因此為了更好地發揮出抗腫瘤免疫效應，可以在放療的同時進行抗CTLA-4治療。目前抗CTLA-4藥主要是指Ipilimumab（IPI），它是最早被批準用于臨床的針對Treg的靶向藥，也是治療晚期惡性黑色素瘤的首選藥物。Rudqvist等在乳腺癌小鼠模型中發現，在對抗CTLA-4單藥耐藥的情況下，放療和抗CTLA-4可顯著增加腫瘤浸潤性淋巴細胞的數量，且改善小鼠的存活率。目前越來越多的報道證實了放療聯合全身免疫治療的安全性和有效性。Bang等回顧性分析了多種腫瘤在接受放療聯合免疫治療后，證明了局灶性姑息性放療與CTLA-4和（或）程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）抑制劑聯合使用具有良好的耐受性。Formenti等報道了一項Ⅱ期臨床試驗的結果，該試驗評估了局部放療和IPI在轉移性非小細胞肺癌患者中的療效，結果顯示客觀緩解率（objective response rate，ORR）及無進展生存期（progressionfree survival，PFS）均優于歷史上報道的單獨使用IPI。Ji等發現與單獨放療相比，抗CTLA-4聯合放療使腫瘤消退明顯，且顯著改善臨床結果。

5.2 抗GITR單抗聯合放療

Treg細胞上的另一熱門靶點是GITR，其是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體蛋白家族的一員，在調節性細胞上結構性表達，效應T細胞上誘導表達的共刺激受體。研究表明，GITR與GITR配體相互作用可為CD4和CD8初始T細胞提供共刺激信號，激活效應T細胞，同時抑制Treg細胞的抑制活性。近年來，GITR作為一個有前景的靶點得到了廣泛的研究，激動劑GITR單抗通過增加效應T細胞活性、減少Treg細胞浸潤增強抗腫瘤反應。Patel等的小鼠膠質瘤模型實驗結果顯示，抗GITR單抗聯合放療提高了瘤內CD4T細胞/Treg細胞比例，促進了腫瘤消退，并顯著提高生存率。然而，近幾年抗GITR單抗聯合放療相關文獻報道較少，有待進一步觀察GITR對輻射增敏的效果。

5.3 抗CD25聯合放療

CD25抗原是分子量為55 kD的單鏈糖蛋白，又稱IL-2受體，主要表達于活化的T細胞，其配體IL-2是CD8CTL細胞擴增所必需的。Treg細胞可表達更高親和力的IL-2受體，在腫瘤微環境中超過效應T細胞以獲得有限的IL-2，并獲得比效應T細胞更大的增殖優勢，進一步促進免疫抑制。Oweida等的動物實驗顯示，與單純放療相比，抗CD25治療聯合放療可增強T細胞的細胞毒性，誘導腫瘤抗原特異性記憶反應，使57.1%的小鼠腫瘤消失。Ji等進一步證明放療聯合抗CD25單克隆抗體較單純放療在腫瘤中降低Treg，并逆轉了放療時腫瘤CD8T細胞和CD4T細胞上PD-1表達增加，抑制了局部放療及遠處未放療腫瘤生長，提高總生存率。然而，也有一些類似研究未能獲得臨床明顯的增強作用，可能的原因是由于活化的效應T細胞也表達CD25，基于CD25的細胞耗竭也可能減少活化的效應T細胞，從而減弱Treg細胞耗竭增強的抗腫瘤免疫作用。考慮到單克隆抗體的給藥時間和劑量也可能是腫瘤免疫中Treg細胞和效應T細胞差異控制的重要因素，因此如何更好地減少Treg細胞又不消耗特異性效應T細胞是進一步需要解決的問題。

5.4 IDO抑制劑聯合放療

IDO-1是機體內天然存在的免疫調節酶，大量的研究發現許多潛在的免疫抑制機制，其中主要機制為微環境中的色氨酸消耗。近年來，人們逐漸認識到腫瘤與色氨酸分解代謝升高之間的關系，色氨酸通過IDO限制酶代謝為犬尿氨酸，使效應T細胞的細胞周期阻滯和（或）失能，同時促進Treg細胞的成熟和激活，在腫瘤免疫逃逸中發揮直接作用。針對該通路的IDO抑制劑近年來進行了火熱的研究，Zhu等發現放療對IDO免疫活性的影響具有劑量依賴性，因此在放療時使用IDO抑制劑可以通過逆轉T細胞衰竭延緩腫瘤生長。Liu等發現IDO抑制劑與放療協同可以下調Treg細胞，激活樹突狀細胞和效應T細胞，這種聯合治療可以增強抗腫瘤免疫并抑制腫瘤進展。

5.5 雙重免疫聯合放療

雙重免疫和放療的聯合應用通過針對免疫逃逸的多種機制增強抗腫瘤免疫反應，比任何單雙療法更能提高生存率。PD-1是Ⅰ型跨膜糖蛋白，1992年首次被發現，主要在活化的T細胞表面表達，其配體PD-L1表達于多種類型細胞如APC、巨噬細胞、腫瘤細胞等，正常情況下兩者結合可使T細胞持續活化狀態中止，防止機體發生自身免疫性疾病，病理情況下PD-L1在腫瘤細胞中的表達明顯高于其他正常細胞，兩者結合抑制了抗腫瘤T細胞活化，促進腫瘤生長。已有多項研究表明，放療聯合抗PD-1/PD-L1治療可以顯著延緩腫瘤生長。Twyman-Saint等通過一項針對轉移性黑色素瘤的臨床試驗及小鼠模型實驗發現，IPI聯合放療可使腫瘤消退明顯，但耐藥性很常見。抗CTLA-4主要是通過抑制Treg細胞從而增加Teff/Treg比例，而放療可使腫瘤細胞表面受體上調，因此其耐藥性可能是由于PD-L1在黑色素瘤細胞中上調，導致T細胞耗竭。該臨床試驗結果證實了高PD-L1對放療聯合抗CTLA-4無反應，黑色素瘤細胞上的PD-L1可以使腫瘤逃避基于抗CTLA-4的治療。這些數據顯示了抗CTLA-4、抗PD-1/PD-L1、放療三者聯合應用的必要性，主要是通過激活不同途徑增強抗腫瘤反應并實現持久的腫瘤應答。還有更多的三聯組合正在被研究，Schoenhals等發現抗GITR、抗PD-1和放療顯著改善小鼠存活率和局部反應，其中半數小鼠無腫瘤，且這些小鼠的CD4和CD8效應記憶細胞增多。另外在一些臨床前實驗中，抗TGF-β、抗PD-1聯合放療也顯示出良好的抗腫瘤效果。這些數據揭示了雙重免疫治療聯合放療克服腫瘤耐藥的潛力。

6 小結與展望

本綜述回顧了Treg的起源、作用以及運用于臨床治療中的研究進展。放療是目前治療腫瘤的重要方法，射線在照射病灶的過程中使機體的免疫功能受到破壞并影響療效，Treg細胞參與了其免疫失能過程。目前已有越來越多的證據表明放療聯合抗Treg治療可逆轉其誘導的免疫抑制，增強放療療效，因此針對Treg細胞的研究已成為當前放療聯合免疫治療的突破點和熱點，尋找更多的Treg抑制劑及如何有效將清除/逆轉Treg與放療最優化聯合，是今后關注的重點。