國家重點研發計劃“食品風險組分毒理學通路鑒別確證技術研究(2017YFC1601702)”進展

針對用傳統的毒理學方法進行毒性物質職業健康安全性風險評估存在耗時費力和食品風險組分毒性預測困難的問題，本研究開展食品風險組分毒理學通路鑒別確證技術方面的研究。

1 研究目的

使用遺傳通路對新型潛在食品風險化合物的遺傳毒性進行篩選和確證，為食品非法添加物對職業健康的危害預防提供信息和技術支撐。

2 研究方法

(1)構效關系分析初篩。研究針對2010年國家衛健委公布的食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品非法添加物品種名單(共6批)，共126種食品添加物。本次研究使用的工具為Toxtree(version2.6.13)，通過輸入各種受試物的原型編碼或化學結構，以決策樹的形式，根據結構警示對物質的遺傳毒性進行分類和預測。

(2)脫細胞彗星實驗模型。該模型的制備過程如下：

制片：從SD大鼠眼眶取約1.5ml靜脈血，制備脫細胞核DNA板。

染毒與漂洗：以細胞裂解液作為染毒緩沖液。按受試物溶液分為高、中、低3個劑量組，以高劑量組為基準，以2倍倍比關系稀釋為中、低劑量組，將純水和相同細胞裂解液作為對照組。

解旋與電泳：在堿性電泳液避光解旋30min。調節電壓25V，電流300mA，在堿性電泳液電泳，室溫30min。

漂洗：用純水漂洗，清洗中和電泳液，洗去過多的鹽(2次，5min/次)。

染色：滴加Gelred熒光染料染色，彗星光學顯微鏡下觀察損傷，然后用專業軟件(CometA1.0)定量分析尾部DNA百分比。該模型與單純脫細胞彗星試驗相比，采樣簡便，省時省力。

(3)細胞彗星實驗。選用繁殖能力強的懸浮細胞YAC-1小鼠淋巴瘤細胞。具體的實驗過程如下：

染毒：將離心后的細胞加入受試物，陰性對照組(二甲基亞砜終濃度<0.05%)，六孔板染毒，每個劑量、每個受試物3個平行對照，共同放入37℃、5%CO的細胞培養箱3h。

涂片：棄上清，收集細胞沉淀與70μl上樣膠涂在彗星載玻片上，作為一個樣本。

裂解：將載玻片浸沒于細胞裂解液，4℃下避光裂解1.5h(裂解液提前30min放入4℃冰箱，去除細胞膜與核膜，做成細胞核DNA板)。

漂洗：從裂解液中取出載玻片，在純水中洗去過多的鹽(2次，5min/次)。

解旋與電泳：在堿性電泳液避光解旋30min。調節電壓25V，電流300mA，在堿性電泳液電泳，室溫30min。

漂洗：用純水清洗中和電泳液，在純水中洗去過多的鹽(2次，5min/次)。

染色：滴加Gelred熒光染料，彗星光學顯微鏡下觀察損傷，用專業軟件(CometA1.0)定量分析尾部DNA百分比。

(4)哺乳動物體內彗星聯合微核實驗。本實驗的動物染毒、取材及過程如下：購買的動物在實驗前適應環境3天，適應期進行檢疫和觀察，期間自由飲水和攝食。受試物用水或食用油作為媒介，溶解或懸浮于媒介中，受試物以灌胃方式給與，大鼠灌胃體積不超過10ml/kg體重，實驗動物隨機分組，每組10只，雌雄各半。陰性對照組為水或食用油，陽性對照組為40mg/kg bw環磷酰胺(CP)，食品非法添加物LD的1/4作為高劑量，中、低劑量組按2倍倍比關系稀釋。2次給受試物間隔24h，第2次給受試物6h后，對動物腹腔注射麻醉，采外周血、分離肝細胞、分離骨髓細胞開展堿性和中性彗星實驗，同時骨髓細胞開展微核試驗。

3 研究成果

(1)確立DNA損傷篩選模型：脫細胞彗星實驗篩選模型、細胞彗星實驗篩選模型、哺乳動物體內彗星聯合微核實驗確證模型。

(2)食品非法添加物中遺傳毒性物質的篩選：完成126種非法食品添加物的篩選，篩選出11種可疑遺傳毒性物質(乙醇、蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、三聚氰胺、黃原膠、誘惑紅、酸性橙(橙黃Ⅱ)、堿性橙、甲醛次硫酸氫鈉二水合物)。

(3)靶器官遺傳毒性聯合確證：采用哺乳動物體內堿性彗星、中性彗星及微核實驗對以上11種可疑遺傳毒性物質短期染毒未發現遺傳毒性；乙醇在一定劑量范圍內致骨髓細胞DNA單鏈斷裂的劑量—反應曲線呈現倒置的“U”字形。骨髓可作為乙醇的靶器官并可產生遺傳毒性。

4 經濟社會效益

(1)對學科/行業產生重要影響。建立的DNA損傷快速篩選，可以實現遺傳物質的快速篩選和確證，完善了遺傳毒理學的方法體系，為職業健康提供重要支持。利用本模型通過初步篩選已經發現的126種非法食品添加物中可能具有遺傳毒性的種物質。為后續開展針對這些物質的職業健康安全性風險評估奠定基礎，同時有助于提高食品安全水平。

(2)對社會民生、生態環境、國家安全等產生積極作用。本課題建立的DNA損傷篩選和確證體系具有靈敏度高、實驗周期短、檢測成本低、對實驗室硬件要求低的特點。從遺傳毒性通路為食品非法添加物的監管、檢測和危害預防提供技術支撐，有助于避免食品安全事件的發生，保障國民生命健康，減輕職業人群的經濟負擔和健康安全風險。

(3)人才、專利、技術標準戰略在項目實施中取得初步成果。項目團隊重視人才培養,積極實施專利技術標準戰略。本年度多名博士生、碩士生正在培養中，豐碩的人才培養成果為推動食品真實性鑒別領域技術發展提供人才支撐。已培養和在培養學生3名；發表論文2篇；獲食品安全國家標準立項1項。