汞、銅、鋅金屬對明亮發光桿菌急性毒性的變化趨勢與相關性探討

張 靜，李 沙，王雪霖，江曉波

（四川省德陽生態環境監測中心站，四川 德陽 618000）

隨著工業化進程的不斷推進，我國環境監測事業得到迅速發展。除傳統理化分析外，生物毒性檢查方法，特別是發光細菌法以其便捷性、全面性在水質連續自動監測、水源地預警監測和突發污染事件應急處理中也得到迅速發展和廣泛應用。

發光細菌法是現今判斷生物急性毒性較為成熟的方法。縱觀國內外研究結果，大多數重金屬物質都對發光細菌有光損失作用，毒物濃度與菌體發光強度呈線性負相關[1]，本文就毒性物質作用于發光細菌的時間、反應體系中濃度與光損失變化、相關性曲線的線性范圍等進行了探討。

1 實驗部分

1.1 原理

發光細菌在有氧條件下通過生化反應產生熒光。當細胞活性升高，發光強度增強。在毒物作用下，細胞活性下降，發光強度降低。因此，水質急性毒性的測定結果可以用相對發光度表示[2]。

1.2 試驗儀器與試劑

（1）儀器：便攜式生物毒性檢測儀，型號UTOX-100，編號UTOX-03040120，廠家：深圳市有為環境科技有限公司

（2）試劑：明亮發光桿菌（-20℃以下冷凍保存）、稀釋液、滲透壓調節液、純水。

（3）標準溶液：汞100 mg/L，銅、鋅1000 mg/L。

（4）實驗設備：移液器100 μl和1 mL、容量瓶100 mL。

1.3 試驗步驟

1.3.1 標準使用液配制

用移液器分別取1 mL汞、銅、鋅標準溶液于100 mL容量瓶中，用純水定容。得使用液濃度：汞1 mg/L，銅、鋅10 mg/L。

1.3.2 有效性試驗

菌種復蘇：從冰箱里取出菌種立即加復蘇稀釋液2.5 mL搖勻，置于室溫（20～25 ℃）平衡15 min后用于測量。

有效性驗證點測定：1號位是空白參照位，儀器默認其相對發光度為100%，先各試管取100 μL滲透壓調節液，后取純水和三個標準使用液900 μL，再向各小試管加入50 μL復蘇好的明亮發光桿菌，混勻，避免產生氣泡影響測定結果。打開溫控模式（20 ℃），設置測量時間15 min，點擊測試。15 min后測得汞、銅、鋅的相對發光度均低于50%，說明測試有效。

1.3.3 曲線點測定

該方法中金屬元素的曲線點配制與常規方法一樣，定容體積為1 mL。每個曲線點做三次取平均，操作步驟同有效性驗證試驗一樣，分別測量5 min和15 min，記錄數據。調整各元素曲線點范圍，直至達到我們預期效果。

2 結果與討論

2.1 數據統計

汞、銅、鋅在5 min和15 min兩個反應時間內的相對發光度值及散點圖見表1～3及圖1～3。

表1 Hg元素

圖1 汞

2.2 分析討論

2.2.1 汞的毒性變化趨勢

圖1可知，汞在兩個測量時間里，相對發光度值接近，不隨時間的增加而降低。觀察曲線走勢，汞在0.02～0.15 mg/L間，相對發光度隨濃度增加而急劇減小；而在0.15～0.20 mg/L這個區間，相對發光度趨于穩定，并不與濃度呈線性關系。可見，測量5 min就能夠代表汞的毒性，我們可以建立0.02～0.15 mg/L間濃度與相對發光度的曲線方程，高于0.15 mg/L，雖能反映汞的毒性，但測量不準確；說明汞濃度越高，本方法越不適用。

2.2.2 銅的毒性變化趨勢

由圖2可知，銅在兩個測量時間里，毒性變化明顯不同。測量5 min，相對發光度平滑緩慢下降，在1.5 mg/L后出現拐點趨于緩慢；當測量15 min，銅的毒性反應增大，相對發光度迅速下降，在1.2 mg/L之后趨于穩定，變化不明顯。可見，15 min的測量時間才能代表銅的毒性，建立15 min范圍在0.2～1.2 mg/L內的曲線方程更有實際運用意義。

圖2 銅

2.2.3 鋅的毒性變化趨勢

由圖3可知，鋅的相對發光度與汞相似，變化小，不隨時間的增加而降低。單條曲線觀察，與銅比較，鋅曲線下降的坡度平緩。可見選用5 min測量時間能夠代表其毒性大小，選擇0.2～2.0 mg/L范圍內相關性較好的點作線性回歸，高于2.0 mg/L，鋅的毒性變化不大，相對發光度達到下限，本方法不適用。

圖3 鋅

2.2.4 曲線建立與相關性檢驗

根據最小二乘法建立汞、鋅、銅的回歸方程，見表4，并做相關性檢驗。

表4 相關線性曲線

表4中曲線方程建立是否具有意義，需對相關系數R進行檢驗。查相關系數臨界值Rα表[3]，比較Rα與R絕對值的大小，只有當曲線R的絕對值≥Rα時，所配的直線才有意義。相關系數臨界值Rα表[3]中，Rα為相關系數的臨界值，它的選擇與測量次數n以及給定的顯著性水平α有關，?為自由度，?=n-2。

（注：Rα為數臨界值；n為樣本總量；α為顯著性水平；?為自由度。）

汞：在0.02～0.15 mg/L線性范圍內，表1測量7次，n=7，?=n-2=5，給定α最高等0.001，故查表[3]得Rα=0.95074，表4中RHg=0.994，大于Rα，故汞的濃度與相對發光度間高度相關。

銅：在0.20～1.2 mg/L線性范圍內，表2測量6次，n=6，?=n-2=4，給定α較高等0.01，故查表[3]得Rα=0.91720，表4中RCu=0.960，大于Rα，故銅的濃度與相對發光度間顯著相關。

表2 Cu元素

鋅：在0.20～2.0 mg/L線性范圍內，表3測量8次，n=8，?=n-2=6，給定α最高等0.001，故查表[3]得Rα=0.92493，表4中RZn=0.979，大于Rα，故鋅的濃度與相對發光度間高度相關。

表3 Zn元素

比較表4三個元素相關系數R大小，RHg最接近1，符合GB/T15441-1995《水質 急性毒性的測定 發光細菌法》[4]中以氯化汞為標準溶液的要求，鋅、銅次之。

2.2.5 低毒時濃度點值確定

中國科學院南京土壤研究所以氯化汞為參比毒物，用其相對發光度和與其相對應的氯化汞濃度表達毒物等級，將水質毒性分為5個等級[5]，見表5。

表5 水質毒性等級

根據表5定義相對發光度為70%時，毒物毒性為低毒等級，于是我們將70%代入汞曲線計算，得到汞濃度0.06 mg/L，小于0.07 mg/L，符合表5定義。同理計算銅和鋅的低毒濃度值是0.63 mg/L、0.95 mg/L，三者毒性大小關系：汞＞銅＞鋅。

3 結論與意義

3.1 汞、銅、鋅對明亮發光桿菌的急性毒性都有顯著效應，都與相對發光度成顯著負相關，毒性強度明顯不同，汞>銅>鋅。根據中國科學院南京土壤研究所對毒物等級的評價，最低毒性劑量分別在0.06 mg/L、0.63 mg/L、0.95 mg/L左右。

3.2 三種金屬對明亮發光桿菌發揮的毒性作用時間不同，汞、鋅作用5 min能夠完全代表物質的毒性大小，而銅則需要15 min更為準確，在應急監測過程中，能為我們提供更為快速、準確的方法。

3.3 汞濃度超過0.15 mg/L，鋅濃度超過2.0 mg/L，而銅在15 min測量模式下超過1.2 mg/L時，相對發光度達到下限，測量結果不準確，本方法不適用。

3.4 建立了三個元素在此方法中相對準確的曲線方程及線性范圍，見表4。檢驗其相關性得到汞＞鋅＞銅，符合國標。