采用液相色譜法檢測牛肉中五種磺胺類藥物

任 展 黃建林 郝建格

（四川省漢源縣農產品質量安全監督檢驗檢測站，四川 漢源 625300）

農質發〔2014〕5號文件附件8《磺胺類藥物在動物可食性組織中殘留的高效液相色譜檢測方法》指出該方法適用于豬肉中五種磺胺類藥物（磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧噠嗪、磺胺喹惡啉）殘留檢測，為探究該方法的適用范圍，本文在 方法定量限50μg/kg、最大殘留限100μg/kg、2倍最大殘留限200μg/kg三個濃度點進行三水平添加回收試驗。采用多點溶劑外標和相鄰濃度的基質標進行校準，并用相對響應值法來評價兩種方式的定量結果差異，考查以牛肉為基質時的基質效應和方法的定量限、正確度、精密度能否滿足 檢測方法和NY/T 1896-2010《獸藥殘留實驗室質量控制規范》的相關要求，以此評價能否運用該方法對牛肉組織樣品中五種磺胺類物質進行檢測。

本文的基質效應的評價方式為：基質效應（%）=B/A×100%，A:用溶劑標校準的回收量，B:用基質標校準的回收量。 當基質效應為90% ～110%時，則認為兩種校正方式不存在顯著差異，采用溶劑標進行校準；反之，則認基質效應對檢測結果有顯著影響，采用基質標進行校準。

1.試驗方法

1.1 儀器、試劑和材料

儀器設備：Agilent 1260高效液相色譜儀（配紫外檢測器）、華志HZT-A300百分之一電子天平、鄭州長城科工貿R-1001VN旋轉蒸發儀、固相萃取裝置、蜀科TGL-17離心機、艾卡T18勻質器。

試劑耗材：乙腈（色譜純）、 甲醇（色譜純）、正己烷（色譜純）、冰乙酸（色譜純）、正丙醇（色譜純）、無水硫酸鈉（分析純）、電阻率為18.2MΩ的超純水、體積比為95+5乙腈-水、體積分數70 %乙腈水溶液、CNWBOND堿性氧化鋁柱（2g/10mL）、津騰尼龍微孔濾膜和針頭過濾器（0.22μm）。

標準物質： 農業農村部環境保護科研監測所（天津）1mL、100μg/mL的磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺喹噁啉（SQ）、磺胺二甲氧噠嗪（SDM）。

1.2 標準曲線的制備

將所購置的標準物質溶液用甲醇稀釋配制為10μg/mL的磺胺混合標準儲備液，在-20℃以下冰箱中保存，有效期3個月。

溶劑五點外標：準確吸取五種磺胺類藥物混合標準儲備液，用流動相稀釋成濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、 5.0 μg/mL系列混合標準工作溶液，由低濃度到高濃度供液相色譜儀測定。以峰面積為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。求回歸方程和相關系數。

單點基質標：平行稱取10個空白樣品，經前處理后，得到約20mL混合基質溶液。準確吸取一定體積的5.0 μg/mL五種磺胺類藥物混合標準工作液，用此基質溶液稀釋成濃度為0.12μg/mL、0.25 μg/mL、0.5μg/mL的基質標準溶液。

1.3 前處理

提取：稱取牛肉組織樣品5（±0.05）g于50 mL塑料離心管中，加入15 mL乙腈和4 g無水硫酸鈉，以10000 r/min的速度均質1 min后，用3000 r/min的速度離心5 min，將上層清液轉移至另一離心管中；再在下層殘渣中加入15 mL乙腈，渦旋混勻1 min后，以3000 r/min速度離心5 min，合并兩次的上清液于同一離心管中，在此離心管中加10 mL正己烷，振蕩5 min后進行離心分層，取下層液體至100 mL雞心瓶中，并加入5 mL正丙醇，在50 ℃水浴下旋轉蒸發至近干，加 95+5的乙腈-水3 mL，渦旋混合1 min，超聲2 min，作為備用液。

凈化：取 95+5的乙腈-水3 mL活化堿性氧化鋁小柱，將上述備用液倒入堿性氧化鋁柱中過柱，再用95+5的乙腈-水5 mL洗滌雞心瓶后過柱，不收集；小柱內溶液完全流出后，用負壓抽干小柱；用10 mL 70%乙腈水溶液洗脫，收集洗脫液于100 mL雞心瓶中；加入正丙醇5 mL后，用50 ℃水浴旋轉蒸發至干，準確加入2.0 mL流動相溶解，渦旋1 min超聲2 min，過0. 22 μm濾膜后，用高效液相色譜儀進行測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18，250mm×4.6mm（i.d.），粒徑5μm；

流動相：甲醇-乙腈-水-冰醋酸（2+2+9+0.2）；

流速：1 mL/min；

進樣量：20 μL；

柱溫：30 ℃；

檢測波長：270 nm。

2.試驗結果

從色譜圖可以看出（如圖1、2、3、4、5所示），樣品經前處理后，在五種磺胺目標物的出峰區域無干擾情況存在；五種磺胺類藥物的峰形尖銳、對稱性好、保留時間穩定，所有物質均能在17 min內完全流出分離。

圖1 試劑空白色譜圖

通過對基質效應的計算，牛肉基質對五種磺胺類藥物的響應值影響不顯著，故使用溶劑標對試驗結果進行校準，并在此校準方式下對結果的正確度和精密度進行計算。以五種磺胺類藥物的濃度（μg/mL，x）和相對應的響應值（峰面積，y）進行線性回歸，線性方程如表1所示，相關系數r均大于0.999。在定量限、最大殘留限量、2倍最大殘留限量濃度水平下的檢測結果如表2所示 ，五種磺胺類藥物回收率在 70.6%～87.0%之間、相對標準偏差（RSD）在2.1%～8.8%之間，上述結果均符合此檢測方法和NY/T 1896-2010中正確度（70%～110%）和精密度（RSD ≤ 15%）的要求。

通過對方法的選擇性、基質效應、線性范圍、定量限、精密度和正確度方法特性的驗證，表明該方法同樣適用于牛肉基質中五種磺胺類藥物殘留的檢測。

圖2 空白樣品色譜圖

圖3 各組分濃度為0.25μg/mL的牛肉基質配標色譜圖

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3.注意事項

使用該方法對牛肉中五種磺胺類藥物進行檢測屬于超出標準規定范圍使用標準方法，根據GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》中允許方法偏離的規定，此種方式屬于允許偏離標準方法的范圍，但此方法偏離后應經實驗室驗證，編制偏離標準的作業指導書，經審核批準后方可使用。

試驗中為保證回收率達到規定要求，在前處理過程中有幾個關鍵點應需注意，否則回收率將會受到嚴重影響。在旋蒸過程中應注意對近干的控制，第一次旋蒸過干不利于磺胺類藥物的復溶，會導致回收率降低；上樣和洗脫時，應控制溶液過柱的流速（1mL/min為佳），過快的流速會導致回收率降低；堿性氧化鋁柱的極性較強，在活化、上樣中應嚴格控制各溶液中水分的比例，若水分比例過高，上樣過程中會導致磺胺類藥物從柱中直接流走，導致部分藥物回收率過低甚至沒有回收。