不同方法提取黑果枸杞花色苷效果比較

李國秀 王晶金 高婷彥 鄭浩睿 唐 琳

（四川大學生命科學學院，四川 成都 611100）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科枸杞屬植物，果實中富含大量的花色苷，具有抗氧化、抗衰老、降血脂等功效。

目前國內外實驗室花色苷提取的常用方法：有機溶劑萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和生物酶輔助提取法。雙水相萃取花色苷是近年隨著生物學的發展興起的一種新型提取方法。與常用方法相比，雙水相萃取花色苷具有諸多優點，如一步實現提取分離，提取條件溫和，經濟節約等。在目前報道中，常使用水/乙醇/無機鹽雙水相系統萃取植物材料中的花色苷類物質，花色苷傾向于向上相乙醇富集相分配，總糖類物質傾向于向下相鹽富集相分配，從而達到提取分離目的。

常用花色苷提取方法輔助手段單一，本文采用超聲波與纖維素酶兩種輔助手段提取黑果枸杞花色苷。本文中雙水相萃取法使用的無機鹽硫酸銨與磷酸二氫鈉均為弱酸性鹽，與無水乙醇所形成的雙水相體系呈酸性，剛好符合花色苷在酸性條件下更加穩定的特性。

目前關于黑果枸杞中花色苷的雙水相萃取研究鮮見報道；與常用提取方法相比，雙水相萃取黑果枸杞花色苷成分變化分析未見報道。基于研究現狀，本文以花色苷含量、多糖去除率、花色苷色價和花色苷成分分析為指標多方面比較雙水相萃取和超聲酶輔助提取花色苷的效果。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

以青海地區的黑果枸杞為實驗材料，經四川大學生命科學學院白潔副教授鑒定為茄科枸杞屬黑果枸杞。

纖維素酶(成都瑞芬思公司)；AB-8大孔樹脂(上海紫銘試劑廠)；乙醇、鹽酸、磷酸二氫鈉、硫酸銨均為分析純(成都市科龍試劑化工廠)；MS半微量電子精密分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；離心機H1850型(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；UV1600紫外分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；冷凍干燥機（寧波市鄞州儀器有限公司）；旋轉蒸發器RE-52AA型（上海亞榮生化儀器廠）；PH計（希瑪科技有限公司）；X500B Q-TOF液質聯用儀（SCIEX公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理

黑果枸杞干果烘干，粉碎，過40目篩，備用。

1.2.2 超聲酶輔助提取黑果枸杞花色苷

1.00 g黑果枸杞粉末置于50 mL離心管中，依次加入25 mL 75%乙醇溶液、1.00 mg纖維素酶，用1% HCl(v/v)調節溶液pH為3.0，避光45℃超聲輔助提取30 min；使用高速離心機4000 rpm/min，離心20 min，收集上清；將上清用70%酸性乙醇溶液（pH3.0）定容至100 mL，即得提取液。

1.2.3 雙水相萃取黑果枸杞花色苷

一定質量分數的無機鹽和去離子水加入50 mL離心管中，待無機鹽完全溶解后，再加入一定質量分數的乙醇，使得溶液體系的總質量為48.00 g；1.00 g黑果枸杞粉末加入離心管中，45℃超聲輔助提取一定時間（乙醇/硫酸銨體系：乙醇質量分數25%，硫酸銨質量分數23%，時間36 min。乙醇/磷酸二氫鈉體系：乙醇質量分數24%，磷酸二氫鈉質量分數為27%，時間37 min）。超聲結束，4000 rpm/min，離心20 min，收集上下相溶液；將上下相溶液用70%酸性乙醇（pH=3.0）定容至100 mL，即得提取液。

1.2.4 總花色苷含量測定

花色苷含量的測定采用pH示差法：將提取液分別用pH1.0和pH4.5的緩沖溶液稀釋10倍，在避光條件下平衡90 min。平衡結束，使用紫外分光光度計分別測定各提取液的平衡溶液在528 nm、710 nm波長下的吸光值。按以下公式計算所得黑果枸杞花色苷含量：花色苷含量(mg/g)=[(A528-A700)pH1.0-(A528-A700)pH4.5]×Mw×DF×V/(ε×L×m)，式中：Mw，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的相對分子質量，449.2 g/mol；DF—稀釋因子；V—提取液的體積，100 mL；E—摩爾消光系數，29600 L/(mol·cm)；L—光程厘米數，1 cm；m—黑果枸杞粉末的質量，1.00 g。

1.2.5 花色苷色價測定

提取液在45℃條件下旋轉蒸發，-80℃冷凍干燥24 h，得到紫黑色黑果枸杞花色苷樣品。準確稱取黑果枸杞花色苷樣品1.00 g，采用pH3.0的70%乙醇進行稀釋一定倍數，在528 nm處測其吸光值，用以下公式計算黑果枸杞花色苷色價：E=A×DF/W。式中：E—花色苷色價；A—吸光度值；DF—稀釋倍數；W—黑果枸杞粉末質量。

1.2.6 多糖去除率測定

采用苯酚-硫酸法測定，繪制標準曲線：Y(吸光值)=71．266X(葡萄糖溶液濃度)+0.0301(R2=0.9982)。用以下公式計算多糖去除率：多糖去除率(%)=C下V下/(C上V上+C下V下)×100。式中：C上—上相中的總糖含量；C下—下相中的總糖含量；V上—上相溶液體積；V下—下相溶液體積。

1.2.7 花色苷的純化

1.2.7.1 花色苷樣品的準備

提取液45℃旋轉蒸發，-80℃冷凍干燥，得到花色苷粗品。

1.2.7.2 AB-8大孔樹脂純化

準確稱取1.00 g花色苷粗品溶于100 mL的80%酸化純水中作為上樣液，純水用1% HCl預先調至pH3.0，控制流速為1.0 mL/min上樣。待上樣平衡后，用1% HCl調至pH3.0的80%乙醇溶液洗脫花色苷，待洗脫液開始有顏色時開始收集花色苷。對收集的花色苷純化樣品進行45℃旋轉蒸發，然后-80℃冷凍干燥，備用。

1.2.8 UPLC-QTOF-MS/MS質譜分析花色苷成分

1.2.8.1 供試液的制備

取一定量“1.2.7.2”中得到的花色苷樣品溶于50%色譜甲醇(0.1%甲酸，v/v)中，12000 rpm/min，離心5 min，然后過0.22 μm濾膜，相同的操作反復3次。

1.2.8.2 色譜條件和質譜條件

色譜條件：采用X500B Q-TOF液質聯用儀的C18反 相 色 譜 柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流 動 相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫條件為0-10 min，0%～20%B；10～15 min，20%～30%B；15～17 min，30%～95%B；流速0.4 mL/min；進樣量3 μL。質譜條件：正離子模式檢出，離子源溫度500℃，m/z范圍50～1200，離子化電壓5500 V，噴霧氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，氣簾氣30 psi。

1.2.9 數據分析

實 驗 重 復 三 次，采 用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,USA)，實驗結果以平均數±標準差表示(Mean±SD)進行數據分析。

2.結果與分析

2.1 基于花色苷含量比較

將超聲輔助雙水相萃取得到的花色苷含量與超聲酶輔助提取得到的花色苷含量進行對比，發現三種方法均能對黑果枸杞中的花色苷進行有效提取。

表1 不同提取方法下花色苷含量對比Table 1 Comparison of color content of anthocyanins under different extraction methods

2.2 基于花色苷色價比較

表2 不同提取方法下花色苷色價對比Table 2 Comparison of color value of anthocyanins under different extraction methods

結果表明，兩種雙水相萃取得到的花色苷色價是超聲酶輔助法的2倍。這可能是因為在雙水相萃取過程中花色苷更傾向于上相水相中分配，多糖更傾向于下相無機鹽相中分配，這使得通過雙水相萃取得到的花色苷色價更高，意味著雙水相萃取的花色苷純度更高。

2.3 基于多糖去除率比較

乙醇/硫酸銨雙水相萃取花色苷可以除去90.62%的多糖，乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取可以除去82.16%的多糖。多糖被作為雜質被除去后，花色苷的純度相應的增加，這與色價的比較結果形成了相互印證。

2.4 花色苷成分分析

采用超聲酶輔助提取法和乙醇/硫酸銨、乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取法提取的花色苷粗提液經過AB-8大孔樹脂純化后，分別進行UPLC-QTOF-MS/MS質譜鑒定，結果見表3。在相同的色譜條件和質譜條件下，相同的保留時間，三種提取方法下經過大孔樹脂純化的花色苷均鑒定出了15種相同的花色苷。在其他保留時間下，未發現三種方法下提取的花色苷成分有差異。這說明了雙水相萃取相比超聲酶輔助法能夠完全保留黑果枸杞中的花色苷。

表3 花色苷成分分析Table 3 Analysis of anthocyanins

3.結論

本研究采用超聲酶輔助提取法和乙醇/硫酸銨、乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取法提取黑果枸杞中花色苷，基于花色苷含量、花色苷色價、多糖去除率、花色苷成分分析對花色苷提取效果進行比較。

結果表明，雙水相萃取花色苷含量與超聲酶輔助法相比無顯著差別，但是純度提高了2倍。乙醇/硫酸銨雙水相萃取花色苷可以除去90.62%的多糖，乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取可以除去82.16%的多糖。在相同的色譜條件和質譜條件下和相同的保留時間，三種提取方法下經過大孔樹脂純化的花色苷均鑒定出了15種相同的花色苷。這說明了雙水相萃取相比超聲酶輔助法能夠完全保留黑果枸杞中的花色苷。

通過本文研究，與超聲酶輔助法相比，雙水相萃取法更加適用于花色苷的提取，為雙水相萃取黑果枸杞花色苷積累了基礎資料。