西藏林芝市察隅縣水稻根際土壤可培養酵母菌多樣性及其與理化因子相關性

王艷紅 郝兆 張艷茗 郭小芳 德吉

摘要：【目的】開展林芝市察隅縣水稻根際土壤可培養酵母菌多樣性研究，并探究其與土壤理化因子的相關性。【方法】采用稀釋涂布法分離純化酵母菌，并采用rRNA ITS區域序列分析與經典分類法對酵母菌菌株進行鑒定。采用R 3.6.1分析可培養酵母茵多樣性及其與土壤理化因子之問的關系。【結果】從林芝市察隅縣水稻根際土壤中共分離得到352株酵母菌，分屬于10個屬13個種，優勢種為Cryptococcuspodzolicus Pearson相關系數顯示，全氮和全磷與酵母菌種數及屬數呈極顯著止相關，全氮與酵母菌Shannon-Wiener多樣性指數、Simpson多樣性指數呈極顯著止相關，與Pielou均勻度指數呈顯著止相關，全磷與Shannon-Wiener多樣性指數呈顯著止相關;全氮與 Candidapseudolambica、Goffeauzyma gastrica、Papiliotrema aspenensis以及Solicoccozyma terricola呈顯正相關;全磷與Goffeauzyma gastrica和Solicoccozyma terricola呈極顯著正相關，與Candida pseudolarribica呈顯著止相關;含水量與Papiliotrema aspenensis呈極顯著止相關。【結論】小同土壤理化因子對水稻根際酵母菌的影響程度不同，其中全氮和全磷是影響水稻根際酵母菌群落結構的主要因素。

關鍵詞：青藏高原;水稻;根際土壤;多樣性;酵母菌;理化因子

中圖分類號：0 938

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 07-0817-09

Relationship between Environmental Factors and Diversity of Culturable Yeasts in

Rhizosphere Soil of Rice Field on Tibetan Plateau

WANGYanhong 1， HAOZhao 1. ZHANGYanming 2， GUOXiaofang 1*， Deji l*

（1.School of Science. Tibet University. Lhasa. Xizang

850000， China; 2.National Key Laboratory ofllybrid Rice/

College ofLife Sciences， Wuhan UniversiN. Wuhan. Hubei

430072. China）

Abstract：【Obj ective】Diversity of culturable yeasts in thizosphere soil of rice fields at Zayii County， Nyingchi City， Tibetwas determined and its correlation with the environmental factors analyzed.【Method】 Yeasts from the soil samples wereisolated by dilution with a streaking plate method and identified by sequencing ITS domains of rRNA gene and conventionalclassification. Software R 3.6.1 was used to examme correlations between the yeast diversity and environmental factors【Result】A total of 352 yeast strains of 10 genera and 13 species dominated by Cryptococcus podzolicus were isolated. Thenumbers extremely significantly correlated with the contents of total nitrogen （TN） and total phosphorus （TP） in the habitatthizosphere soil. TN extremely significantly correlated to both Shannon-Wiener and Simpson diversity indices andsignificantly correlated to Pielou evenness index. but TP only significantlv correlated to Shannon-Wiener diversity indexAt species level. the abundance of Candzida pseudolarnbica， Goffeauzyma gastrica， Papiliotrema aspenensis， andSolicoccozvma terricola significantly correlated to TN.G gastrica and&terricola extremely significantly and Cpseudolambica significantly correlated to TP. andP. aspenensis extremely significantly correlated to the water content （WC） in soil.【Conclusion】 Different environmental factors affected differently on the thizosphere yeast community on rice fields in theregion. TN and TP in soil appeared to play a prominent role in that respect.

Key words： Tibetan Plateau; rice field; thizosphere soil; yeast; diversity; environmental factors

0 引言

【研究意義】水稻是世界上最重要的農作物之一，全球種植面積達1.43億公頃，穩定的稻田生態系統對水稻的良好生長及水稻耕種的可持續發展具有重要意義[1]。土壤作為水稻的生長基質，是地球上最為龐大的“微生物倉庫：對推動生物地球化學循化及實現社會經濟可持續發展具有重要的作用[2-3]。土壤微生物對維持稻田土壤肥力、調節土壤營養物質循化以及促進水稻的養分吸收具有重要意義，是維持稻田生態系統持續發展的重要驅動者[4-7]，對水稻的生長及產量有深刻的影響[8]。【前人研究進展】近年來，對稻田土壤微生物的研究陸續開展，多數研究聚焦于稻田土壤細菌群落，對稻田土壤真菌的研究相對較少，尤其是關于水稻根際土壤酵母菌尚待深入研究。吳朝暉等[9]研究顯示，土壤細菌和古菌群落主要受土壤速效養分影響。理鵬等[1O]研究表明，糞肥的施用增加參與稻田氮循環細菌的豐度，對稻田土壤氮平衡起正向作用，且雞糞和豬糞的施用會增加稻田病原菌，對稻田土壤健康有一定威脅。方萍等[ll]通過研究施用微生物菌肥對水稻根際細菌的影響發現，施用微生物菌肥明顯增加了水稻根際土壤細菌的數量。崔月貞等[12]通過研究新型肥料對漢中盆地水稻土壤微生物的影響發現，新型肥料可提高水稻土壤微生物的數量和改善微生物的群落結構。卓晨等[13]研究表明，水稻土壤細菌、真菌及綠藻可通過降低土壤中鎘的生物利用率、調控水稻對鎘的吸收轉運、提高水稻抗氧化能力等途徑緩解重金屬鎘對水稻毒害作用。張奇等[14]研究顯示，水稻土壤真菌與細菌的比例會影響水稻土壤微生物碳源代謝，從而影響土壤微生態環境，最終影響水稻化感抑草作用。陸紅飛[15]通過枯草芽孢桿菌和酵母菌配施對再生水灌溉土壤生境和水稻生理生化影響的研究發現，施加枯草芽孢桿菌和酵母菌會使土壤理化因子發生變化，并改變水稻的生理狀態，從而提高水稻的產量。【本研究切入點】酵母菌作為土壤微生物群落的重要成員，與土壤生態系統各部分存在廣泛聯系，是土壤細菌及原生態掠食者的重要營養來源，對增加土壤養分、優化土壤環境、促進植物生長具有重要作用[15]。酵母菌作為一類單細胞真核微生物，在多數關于土壤微生物的研究中，酵母菌由于生物量占比較小，其在土壤生態系統中的作用往往不能被很好地呈現。目前以土壤酵母菌為研究對象的報道相對較少，關于水稻根際土壤酵母菌的研究相對匱乏。林芝市察隅縣作為青藏高原地區為數不多種植水稻的地區，具有獨特的地理環境和氣候條件。本研究基于純培養方法，對采白林芝市察隅縣的17份水稻根際土壤樣品進行酵母菌的分離，采用rRNA ITS區域序列分析與經典分類法對酵母菌進行鑒定，分析土壤酵母菌種群結構組成、多樣性及土壤理化因子的差異性，解析其變化特征，并運用R 3.6.1分析酵母菌多樣性及不同物種對根際土壤理化因子的響應特征。【擬解決的關鍵問題】研究該地區水稻根際土壤酵母菌多樣性以及土壤理化因子對其的影響，為深入了解稻田生態系統根際生態過程，維持和提高稻田生態系統生產力提供理論依據，并為青藏高原特殊微生物資源的開發利用提供有價值的資源。

1材料與方法

1.1研究區域概況及土樣采集

青藏高原平均海拔超過4 000 m，素有“世界屋脊”之稱，是地球上最獨特的生態地理單元[16]。本研究區域位于西藏自治區林芝市察隅縣（ 95°4l'32"～98°45'08"E、27°44'21"～29°32'42"N），因地形特殊的原因，該區域既受到孟加拉灣暖濕氣流的影響，又受到青藏高原高寒高壓系統的影響，氣候發生從熱帶或亞熱帶氣候到溫帶、寒溫帶和寒帶氣候的垂直變化，年日照時數1615.6 h，年平均氣溫為12.1℃，3—10月為雨季，全年降水量為791.3 mm，年均無霜期達215 d[17-18]。

2019年10月在察隅縣竹巴村、格擁村、慈巴村等種植水稻的村落隨機選擇17個樣點進行水稻根際土壤樣品采集（圖1）。除去表面雜質后，利用土壤采集器采用多點混合法采集靠近水稻植株根系的地下0—10 cm土壤樣品。土樣混合后分為2份，一份用于土壤理化因子的測定，另一份帶回實驗室后立即進行酵母菌的分離。pH值、溫度的測定直接在采樣點進行。

1.2水稻根際土壤可培養酵母菌的分離及純化

采用稀釋涂布法分離林芝市察隅縣水稻根際土壤酵母菌[19]。取土樣10 9，加入無菌水90 mL，充分振蕩30 min制成土壤混懸液，并分別稀釋至10-3、10-4，用移液器取200 uL土壤稀釋液涂布于酸化的YM、YPD以及PDA培養基平板上，每個處理設置3個重復，培養3～5 d后對酵母菌進行觀察計數，純化采用平板劃線法。

1.3水稻根際土壤可培養酵母菌的分子鑒定

采用rRNA ITS序列分析進行酵母菌鑒定。1.3.1 DNA提取及擴增 DNA提取采用成都新百基生物科技有限公司-XPure Soil DNA Extraction Kit提取試劑盒進行。引物ITSI（5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG一3'）.ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'）。PCR擴增反應程序為：98℃3mm;98℃10 s，退火溫度10 s，72℃10 s，36個循環;72℃5 min。1%瓊脂糖凝膠檢測擴增目標產物后送往成都丹鳳科技有限公司進行測序。

1.3.2序列分析 供試菌株rRNA ITS測序結果經人工校對后在GenB ank核酸序列數據庫中進行同源搜索，與已知酵母菌序列相似度為99%以上的，確定為同一種。

1.4水稻根際土壤理化因子的測定

pH采用pH計測定，溫度采用多功能參數儀測定;全氮、全磷及全鉀送往四川藍城檢測技術有限公司檢測;土壤含水量采用烘干法測定，稱取100 g土壤，105℃烘箱內烘干6～8 h至恒重，稱量土壤干重并計算各樣點土壤含水量。

1.5數據處理與分析

采用Excel 2019、R 3.6.1、SPSS 20.0等軟件進行數據的處理與分析。Shannon-Wiener多樣性指數、Simpson多樣性指數、Pielou均勻度指數及Pearson相關系數均采用R 3.6.1進行計算。差異性分析使用SPSS 20.0軟件中的Duncan's檢驗法進行。

2結果和分析

2.1林芝市察隅縣各樣點水稻根際土壤可培養酵母菌群落組成特征

如表1所示，林芝市察隅縣17個不同樣點水稻根際土壤中獲得的352株酵母菌，分屬于10個屬13個種，Candida、Papiliotrema、Solicoccozyma三個屬分別分離出2個種，其余7個屬均只分離出一個種。分析不同種水稻根際土壤酵母菌I斗l現頻率可知，C podzolicus出現頻率最高，為0.65，C saturnus、S.cresolica、S.aeria三個種的出現頻率最低，均僅在一個樣點被分離到。分析不同種水稻根際土壤酵母菌相對豐度可知，C podzolicus相對豐度最高，為0.36，其次是C vartiovaarae，為0.23。綜合出現頻率和相對豐度可知，林芝市察隅縣各樣點酵母菌的優勢種為C podzolicus。

2.2林芝市察隅縣各樣點間水稻根際土壤可培養酵母菌相似性分析

為了解林芝市察隅縣各樣點間水稻根際土壤可培養酵母菌種類的相似性，計算各樣點間水稻根際土壤可培養酵母菌種Jaccard相似性系數（圖2），林芝市察隅縣各樣點間水稻根際土壤可培養酵母菌的Jaccard相似性系數范圍在0.00～1.00，其中86組為極度不相似（ 0.00～0.25），占比63%，17組為中度不相似（ 0.25～0.50），占比13%，22組達到中度相似水平（ 0.50～0.75），占比16%，11組達到極度相似水平（ 0.75～1.00），占比8%。各樣點間酵母菌物種組成不相似比例為76%，表明林芝市察隅縣各樣點水稻根際土壤可培養酵母菌種類存在較大差異。

2.3林芝市察隅縣各樣點水稻根際土壤可培養酵母菌多樣性指數

如圖3所示，2號樣點分離得到的酵母菌屬數和種數最多，分屬于7個屬8個種，其次為1號樣點，分屬于5個屬7個種，6號、7號等9個樣點均僅分離得到1個種，屬數和種數最少;采用SPSS 20.0對17個樣點的酵母菌總豐度進行差異性分析可知，4號樣點總豐度顯著高于除10號樣點外的其他樣點，16號樣點的總豐度則相對較低;就Shannon-Wiener多樣性指數、Simpson多樣性指數和Pielou均勻度指數而言，三者具有相同的變化趨勢，2號樣點這3種多樣性指數均最高，分別為1.62、0.75和0.38，說明2號樣點水稻根際土壤可培養酵母菌多樣性豐富且均勻，其次為1號樣點，分別為1.40、0.65和0.31。

2.4林芝市察隅縣各樣點水稻根際土壤理化因子差異性分析

采用SPSS 20.0對林芝市察隅縣17個樣點的水稻根際土壤理化因子指標進行差異性分析，結果顯示（圖4），林芝市察隅縣17個樣點的土壤理化因子存在著不同程度的差異。土壤全氮、全鉀和全磷測定結果表明，17個樣點間均存在顯著的差異性（P<0.05），全氮范圍在0.57～3.81 g·kg-l，其中2號樣點顯著高于其他樣點（P<0.05），8號樣點顯著低于其他樣點（P<0.05）;全鉀范圍在16.49--29.79 g·kg-l，其中1號樣點顯著高于其他樣點（P<0.05），3號樣點顯著低于其他樣點（P<0.05）;全磷范圍在0.14—1.66 g·kg-l，其中2號樣點顯著高于其他樣點（P<0.05），11號樣點顯著低于其他樣點（P<0.05）;分析土壤含水量可知，土壤含水量范圍在16.38%—50.34%，3號樣點含水量最高，為50.34%，顯著高于其他樣點（P<0.05），17號樣點含水量最低，為16.38%，顯著低于其他樣點（P<0.05）;就土壤溫度而言，土壤溫度范圍為20.07-- 25.10℃，5號樣點顯著高于其他樣點（P<0.05），為25.10℃，12號樣點顯著低于其他樣點（P<0.05），為20.07℃;就土壤pH而言，范圍在5.88～8.05，其中9號樣點最高，為8.05，顯著高于其他樣點（P<0.05），10號樣點最低，為5.88，顯著低于其他樣點（P<0.05）。

2.5林芝市察隅縣各樣點水稻根際土壤理化因子與可培養酵母菌多樣性指數間的相關性分析

采用R 3.6.1對不同樣點水稻根際土壤理化因子與可培養酵母菌多樣性指數進行Pearson相關性分析并繪制成圖。如圖5所示，土壤酵母菌種數、屬數、Shannon-Wiener多樣性指數、Simpson多樣性指數和Pielou均勻度指數兩兩之間呈極顯著正相關（P<0.01），總豐度與Simpson多樣性指數呈顯著正相關（P<0.05）。

水稻根際土壤理化因子間的相關性分析表明，全氮與全磷、含水量呈極顯著正相關（P<0.01），含水量與全鉀呈顯著負相關（P<0.05），與全磷呈極顯著正相關（P<0.01）。

水稻根際土壤理化因子與可培養酵母菌多樣性指數相關性分析顯示，酵母菌種數和屬數與全氮和全磷呈極顯著正相關（P<0.01）;酵母菌Shannon-Wiener多樣性指數、Simp son多樣性指數、Pielou均勻度指數與全氮呈極顯著或顯著正相關（P<0.05）;Shannon-Wiener多樣性指數與全磷呈顯著正相關（P<0.05）。綜上所述，全氮和全磷是影響林芝市察隅縣水稻根際土壤酵母菌多樣性的主要理化因子。

2.6林芝市察隅縣各樣點水稻根際土壤理化因子與可培養酵母菌物種之間的相關性分析

各樣點水稻根際土壤理化因子與不同酵母菌物種間的相關性分析表明（圖6），全氮與C pseudolambica、G.gastrica、P.aspenensis以及S.terricolo呈顯著正相關（P

3討論

本研究結果表明，C podzolicus在林芝市察隅縣17份水稻根際土壤中的分布和數量都表現出明顯的優勢。C podzolicus為拮抗酵母菌，營養需求簡單、遺傳穩定且對多種病原菌具有控制作用[20]，此類酵母可以通過重寄生和誘導宿主產生抗性的方式幫助宿主抵制病原菌的侵害，在重寄生過程中，酵母菌通過分泌大量的幾丁質酶以及p-i，3一葡聚糖酶等活性物質瓦解其他菌的細胞壁或菌絲體，進而占據優勢[21-22]。C podzolicus具有的較強拮抗和重寄生能力，可能在一定程度上抑制了土壤中其他種類酵母菌的生長進而使其成為研究區域土壤酵母菌優勢種。鑒于C podzolicus在察隅縣水稻根際土壤中的廣泛分布，猜測C podzolicus可能在優化稻田土壤微生物群落以及提升水稻的抗病性方面發揮著一定的作用。

水稻根際土壤理化因子差異性分析結果顯示，不同樣點土壤的理化因子存在著不同程度的差異。例如全氮、全鉀和全磷在各樣點間均存在顯著差異，這可能是由于不同樣點稻田的施肥類型以及施肥習慣差異所造成的。理鵬等[10]研究表明，不同的糞肥處理會導致稻田土壤理化性質的改變進而導致土壤微生物群落組成發生變化，這與本研究結果一致。

從酵母菌分布來看，1號和2號樣點分布著較多種類的酵母菌，結合理化因子可以發現，1號和2號樣點全氮和全磷含量均較高，Pearson相關性分析結果顯示，全氮和全磷是影響林芝市察隅縣水稻根際土壤酵母菌多樣性的主要理化因子，全氮與C pseudolambica、 G.gastrica、P.aspenensis以及S.terricola呈顯著正相關（P<0.05）;全磷與G.gastrica和S. terricola呈極顯著正相關（P<0.01），與Cpseudolambica呈顯著正相關（P<0.05），較高的全氮和全磷含量是1號和2號樣點酵母菌多樣性較高并且以上酵母菌種類在l號和2號樣點大量分布的可能原因。

水稻根際土壤理化因子的變化影響了水稻根際土壤微生物群落結構，微生物群落結構的改變又反過來影響土壤理化因子，兩者相互影響，相互作用[10]。李鴻毅等[23]研究認為，pH及土壤溫度對稻田土壤菌群分布具有顯著影響，而本研究則顯示，土壤全氮和全磷是影響察隅縣稻田土壤酵母菌群落結構的主要理化因子，造成這種差異的原因可能是察隅縣較高的年均溫以及較適宜的土壤pH所導致的。目前國內尚未有對水稻根際土壤酵母菌的研究報道，但存在對天然濕地土壤酵母菌的研究。郭小芳等[24]研究表明，西藏拉魯濕地土壤酵母菌多樣性與土壤理化因子之間沒有顯著的相關性，張愛娣等[25]對濱海濕地土壤微生物多樣性與土壤理化因子相關性研究表明，土壤全氮、全磷顯著影響土壤微生物的多樣性，本研究結果與后者結論一致，由此可推測，天然濕地與包括稻田在內的人工濕地具有相似性，但也有一定的差異。

植物根際微生物影響宿主植物的生長發育及生態適應，通過對植物根際土壤微生物群落進行改造，可增加其對營養物質的吸收效率，減少化肥的使用，從而帶來環境和經濟的效益[26-27]。王孝林等[28]研究表明，水稻根際微生物可影響其對氮利用的效率。因此開展水稻根際土壤微生物群落結構多樣性研究對水稻合理種植具有重要意義。陸紅飛[15]研究表明，水稻土壤理化因子與水稻生理指標之間存在不同程度的相關性。本研究中分離得到的部分酵母菌與土壤全氮和全磷存在顯著相關性，而土壤全氮全磷會影響水稻的生長狀況，今后我們將對根際酵母菌與水稻營養元素利用的關系開展更深層次的研究。

4結論

采用稀釋涂布法從林芝市察隅縣17份水稻根際土壤樣品中分離酵母菌，經典分類方法與分子鑒定技術結果表明，獲得的352株酵母菌，分屬于10個屬13個種，其中C podzolicus為優勢種。不同樣點間酵母菌Jaccard相似性系數表明，察隅縣水稻根際土壤酵母菌群落結構存在明顯的空間異質性。水稻根際土壤理化因子與水稻根際土壤可培養酵母菌相關性分析結果可知，酵母菌種數和屬數與全氮和全磷呈極顯著正相關，根際土壤酵母菌Shannon-Wiener多樣性指數、Simpson多樣性指數、Pielou均勻度指數與全氮呈極顯著或顯著正相關性，酵母菌Shannon-Wiener多樣性指數與全磷呈顯著正相關，綜上所述，土壤全氮和全磷是影響察隅縣水稻根際土壤酵母菌群落組成的主要因素。

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（責任編輯：林海清）

收稿日期：2021-03-11初稿：2021-0428修改稿

作者簡介：王艷紅（ 1994-），女，碩士生，研究方向：微生物生態學（E-mail：1 107057585@qqcom）

通信作者：郭小芳（ 1982-），女，碩士，教授，研究方向：微生物生態學（E-mail：

gxf005@hotmail.com）：德吉（1972-），女，高級實

驗師，研究方向：微生物生態學（E-mail： dg97ll03@163.com）

基金項目：雜交水稻國家重點實驗審（武漢大學）開放課題（KF201808）：2019年中央支持地方高校改革發展基金（藏財教指[2019]01號）