宮腔粘連子宮內膜組織中E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA的表達水平及臨床意義*

伍雯瑩，丁麗君，謝 環

1.湖北省黃石市婦幼保健院婦女保健科，湖北黃石 435000；2.湖北省黃石市婦幼保健院產科，湖北黃石 435000；3.湖北省宜昌市第二人民醫院/三峽大學第二人民醫院婦產科，湖北宜昌 443000

近年來隨著人工流產、刮宮等宮腔操作增加，宮腔粘連發生率呈增高趨勢。宮腔粘連的形成可導致月經紊亂和繼發不孕，即使宮腔鏡宮腔粘連切除手術水平不斷提高，但是術后仍有較高的復發風險，妊娠率仍較低[1]。目前宮腔粘連發病機制尚不十分明確，現有研究認為上皮-間質轉化(EMT)在宮腔粘連發病機制中占有重要地位[2]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是細胞黏附連接的關鍵成分，在細胞黏附和維持上皮細胞表型中起著重要作用[3]。基質金屬蛋白酶9(MMP-9)是基質金屬蛋白酶家族成員，通過分解基底膜纖維連接蛋白、粘連蛋白降解細胞外基質，參與EMT過程[4]。血小板源性生長因子-AA(PDGF-AA)是促進成纖維細胞分裂、趨化的細胞因子，在細胞外基質合成、降解中均扮演關鍵角色[5]。目前E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA在宮腔粘連中均有報道，但較少關注E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA與宮腔粘連患者療效和預后的關系。鑒于此，本研究通過監測宮腔粘連患者子宮內膜組織中E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA的表達，追蹤臨床療效和妊娠結局，探討E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA與宮腔粘連患者臨床特征、療效和預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年6月至2018年7月湖北省黃石市婦幼保健院婦女保健科收治的86例宮腔粘連患者作為宮腔粘連組。納入標準：(1)典型月經異常、周期性腹痛，經宮腔鏡診斷為宮腔粘連；(2)行宮腔鏡手術治療，術中取組織病理檢查，結果完整；(3)有妊娠需求。排除標準：(1)子宮先天畸形；(2)合并生殖器官惡性腫瘤、子宮內膜異位癥；(3)病理標本不合格、配偶不育、隨訪失聯者。宮腔粘連組患者年齡27～39歲，平均(34.21±3.26)歲；病因：有刮宮史35例，有子宮內膜息肉切除史22例，子宮內膜感染16例，雌激素水平降低10例；類型：混合型49例、周邊型37例；Nasr宮腔粘連分級[6]：從峽部粘連(“是”計2分，“否”計0分)、膜狀粘連(“少”計1分，“廣泛”計2分)、致密粘連(“單發”計2分，“多發”計4分)、輸卵管開口(“可見”計0分，“單側可見”計2分，“均不可見”計4分)、管狀宮腔(“是”計10分，“否”計0分)、月經類型(“正常”計0分，“少”計4分，“閉經”計8分)、孕產史(“無不良孕產史”計0分，“復發性流產”計2分，“不孕”計4分)等方面進行評分，輕度(0～4分)41例，中度(5～10分)25例，重度(11～22分)20例；粘連性質：膜性29例，纖維性37例，肌性20例；內膜分期：增殖期39例，分泌期47例；子宮發育：正常62例，異常24例，閉經30例。另選擇同期收治的51例輸卵管性不孕患者為對照組，均經宮腔鏡排除宮腔粘連，年齡26～41歲，平均(35.02±3.53)歲；內膜分期：增殖期26例，分泌期25例。兩組基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已經獲得湖北省黃石市婦幼保健院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1宮腔粘連的臨床治療 宮腔粘連組所有患者均行宮腔鏡宮腔粘連分離術，取膀胱截石位，硬腰聯合麻醉，擴陰器擴開陰道，擴宮棒擴張宮頸，置入宮腔鏡，了解子宮、附件粘連情況，針狀電極分離粘連組織，直至宮腔恢復正常大小和形態，雙側輸卵管開口可見為止，術中應輕柔操作，減少宮腔內膜損傷。術中酌情配合腹腔鏡監視，根據粘連部位不同放置“T”或“O”形宮內節育器預防粘連。術后使用抗生素預防感染，雌激素和孕激素人工周期綜合治療，2～3個月后復查宮腔鏡，恢復正常后取出宮內節育器。

1.2.2免疫組織化學方法檢測E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達 取86例宮腔粘連患者手術切除的子宮內膜組織和51例輸卵管性不孕患者診刮獲取的子宮內膜組織標本，經3.7%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制作4 μm切片，二甲苯中脫蠟，乙醇梯度水化，蒸餾水洗滌，在108 ℃高壓2 min，3%過氧化氫/甲醇溶液室溫下阻斷內源性過氧化物酶活性15 min，1%稀釋正常馬血清(北京太陽紅科技有限公司)37 ℃下孵育30 min，阻斷非特異性抗體結合，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后加入PDGF-AA多克隆抗體、鼠抗人MMP-9 單克隆抗體、E-cadherin 兔單克隆抗體(均購自Abcam 公司)，37 ℃孵育60 min，4 ℃ 冰箱孵育過夜。PBS沖洗3次加二抗，37 ℃孵育17 min，PBS沖洗3次，鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)(購于福建邁新生物技術開發公司)顯色3～5 min，37 ℃孵育30 min，二氨基聯苯胺(DAB)(購于福建邁新生物技術開發公司)顯色3～5 min。再經蘇木素復染、脫水、透明封固，光學顯微鏡隨機選取5個高倍視野進行觀察，放大倍數為400倍。以PBS代替一抗為陰性對照。結果判讀：由湖北省黃石市婦幼保健院病理科2名具有副主任職稱的病理醫師在雙盲條件下獨立采用半定量法進行等級評定[7]，胞質和(或)細胞核中有淡黃色至棕色顆粒被定義為陽性。隨機從各組選擇3張切片，每張切片隨機選取5個高倍視野觀察，先進行染色強度評分(無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)，再進行陽性細胞百分比評分(陰性為0分， <25%為1分，25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分)，染色強度評分與陽性細胞百分比評分相乘的積為免疫反應評分(IRS)。IRS判斷標準：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.2.3宮腔粘連的療效判斷 療效判斷標準：宮腔形態、月經恢復正常為痊愈，宮腔形態、月經基本恢復為顯效，宮腔形態、月經未改善或加重為無效。痊愈、顯效均統計為治療有效[8]。

1.2.4預后隨訪 宮腔粘連患者均定期電話隨訪2年，每3個月1次，了解隨訪期間成功妊娠、分娩情況。

1.3統計學處理 采用SPSS25.0進行數據分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。Spearman秩相關分析E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA表達與Nasr分級之間的相關性；Kaplan-Meier生存曲線分析E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達陰性、陽性的宮腔粘連患者妊娠、成功分娩差異，比較用Log-Rankχ2檢驗。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1宮腔粘連組、對照組患者子宮內膜組織中E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA的陽性表達率比較 宮腔粘連組患者子宮內膜組織中MMP-9、PDGF-AA陽性表達率均高于對照組(P<0.05)，E-cadherin陽性表達率低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 宮腔粘連組、對照組患者子宮內膜組織中E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA陽性表達率比較[ n(%)]

2.2E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA表達與宮腔粘連患者臨床特征、療效的關系 Nasr分級中重度、輸卵管開口不可見、閉經、治療無效的宮腔粘連患者的MMP-9、PDGF-AA陽性表達率高于Nasr分級輕度、輸卵管開口單側或雙側可見、無閉經、治療有效的宮腔粘連患者(P<0.05)，E-cadherin陽性表達率低于Nasr分級輕度、輸卵管開口單側或雙側可見、無閉經、治療有效的宮腔粘連患者(P<0.05)。膜性宮腔粘連患者的E-cadherin陽性表達率高于纖維性和肌性粘連患者(P<0.05)，纖維性粘連患者和肌性粘連患者之間的E-cadherin陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同宮腔粘連項目和療效的患者E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA陽性表達率比較[ n(%)]

2.3E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA表達與Nasr分級的相關性 MMP-9、PDGF-AA表達與Nasr分級呈正相關(r=0.623、0.513，P<0.05)，E-cadherin表達與Nasr分級呈負相關(r=-0.569，P<0.05)。

2.4E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA與宮腔粘連患者預后的關系 隨訪期間宮腔粘連患者妊娠32例，成功分娩22例，均存活。MMP-9、PDGF-AA陽性表達者妊娠率分別為25.00%、27.27%，MMP-9、PDGF-AA陰性表達者妊娠率分別為60.00%、54.84%，MMP-9、PDGF-AA陽性表達者妊娠率低于MMP-9、PDGF-AA陰性表達者，差異有統計學意義(P<0.05)；E-cadherin陽性表達者妊娠率(56.25%)高于E-cadherin陰性表達者(25.93%)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達陰性、陽性患者分娩率比較(25.93%vs.25.00%；20.00%vs.35.48%；16.36%vs.41.94%)，差異均無統計學意義(Log-Rankχ2=0.006、2.303、3.194，P=0.941、0.129、0.074)，見圖2。

圖1 不同E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達宮腔粘連患者妊娠曲線圖

圖2 不同E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達宮腔粘連患者分娩曲線圖

3 討 論

宮腔粘連是子宮內膜損傷后修復障礙最嚴重的并發癥之一。各種原因引起的子宮內膜基底層損傷，可引起內膜上皮細胞再生障礙，并向間質細胞表型轉化和遷移，最終導致細胞外基質過度沉積，成纖維細胞增生，造成宮腔粘連[9]。EMT、細胞外基質沉積是宮腔粘連發病機制的關鍵環節，探討與其相關的分子生物學機制有助于臨床診斷，為治療提供新的思路和靶點，并對預后預測可能起到一定輔助作用。

E-cadherin是鈣黏蛋白家族的一員，在調節鈣依賴細胞黏附和細胞連接形成中發揮不可或缺的作用，E-cadherin細胞質尾部可與各種細胞骨架連接，并介導Wnt、轉化生長因子-β(TGF-β)、核轉錄因子-κB(NF-κB)等多種下游信號轉導，參與調控上皮細胞發育、組織器官形成，維持機體穩態，形成黏附性連接等過程，對維持細胞間隙、細胞相互作用穩態至關重要[10-11]。E-cadherin表達可抑制EMT，促進上皮細胞增殖、分化和遷移，E-cadherin表達缺乏可引起細胞表皮結構異常和EMT進程[12]。MMP-9是調節蛋白水解活動、降解細胞外基質的關鍵酶，參與胚胎發育、血管生成、骨骼發育、傷口愈合、細胞遷移等多種生理過程，MMP-9過表達可誘導EMT過程，促使纖維化疾病進展[13-14]。PDGF-AA是具有多生物學效應的生長因子，屬于血小板源性生長因子14受體家族，具有促使纖維細胞分化增殖、調控間充質干細胞表型轉化等作用[15]。PDGF-AA過表達可導致巨噬細胞、上皮細胞和成纖維細胞之間相互作用，誘導EMT和膠原沉積[16-17]。

本研究結果表明E-cadherin在宮腔粘連患者子宮內膜組織中陽性表達率低于對照組，MMP-9、PDGF-AA陽性表達率高于對照組，且E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達與Nasr分級、輸卵管開口是否可見、是否閉經均有關，說明E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA參與宮腔粘連的發生和進展。動物宮腔粘連大兔模型子宮內膜組織中E-cadherin mRNA表達降低，給予骨髓間充質干細胞外泌體修復子宮內膜24 h 后E-cadherin mRNA表達顯著升高[18]。體外研究顯示重度宮腔粘連患者子宮內膜組織中MMP-9蛋白表達高于非宮腔粘連患者[19]。紀意如等[20]指出PDGF-AA參與宮腔粘連進程。E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA與宮腔粘連臨床療效和預后的關系尚不清楚，目前報道十分少見。本研究通過追蹤臨床治療效果和術后2年內妊娠結局發現E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達與療效和預后均存在關聯，表現為E-cadherin陰性表達、MMP-9和PDGF-AA陽性表達宮腔粘連患者療效差，妊娠率低，說明E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達與宮腔粘連患者預后存在密切關系，可作為預后評估的參考指標。分析其原因為E-cadherin表達缺失，MMP-9、PDGF-AA過表達可加劇細胞外基質降解、上皮細胞表型轉化和EMT過程，為宮腔內膜組織廣泛粘連、纖維化提供良好條件，即便在宮腔粘連分解術后仍能復發和導致較低的妊娠率。

綜上所述，MMP-9、PDGF-AA在宮腔粘連患者子宮內膜組織中陽性表達增高，E-cadherin陽性表達降低。MMP-9、PDGF-AA陽性表達及E-cadherin陰性表達與宮腔粘連加重、療效差有關，可作為宮腔粘連患者預后評估的潛在生物學指標。