限制性胎盤嵌合對無創產前基因檢測的影響*

王 杰，王曉華，武麗瓊，劉雅賢，郭志遠，梁 莊，侯麗青，賈躍旗△

1.內蒙古自治區婦幼保健院遺傳優生科，內蒙古呼和浩特 010010；2.內蒙古大學省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010021；3.內蒙古自治區婦幼保健院超聲醫學科，內蒙古呼和浩特 010010

近年來，隨著分子遺傳學技術的迅速發展，無創產前基因檢測(NIPT)技術在臨床上受到了越來越廣泛的關注。作為一項優秀的產前篩查工具，NIPT技術具有無創、高精度等諸多優勢。它主要通過檢測孕婦外周血漿中的胎兒游離DNA(cffDNA)，對21、18、13-三體和性染色體非整倍體(SCAs)進行篩查，大大提高了這幾種染色體病的檢出率。但是，在這項技術的背后，限制性胎盤嵌合(CPM)一直是困擾大家的難題。CPM是指胎盤內同時存在兩種或多種細胞系，其染色體核型與胎兒存在差異，胎兒染色體核型大多正常。早孕期絨毛活檢(CVS)中CPM 的發生率為1%～2%[1-2]，其中30%～50%的CPM會在妊娠過程中丟失胎盤非整倍體細胞系[3]。而在異常細胞持續存在的病例中，CPM可能會增加不良妊娠結局的風險[4]。本研究對在內蒙古自治區婦幼保健院進行NIPT檢測陽性的孕婦進行產前診斷，并在引產或生育后取胎盤組織進行熒光原位雜交技術(FISH)或染色體微陣列分析(CMA)檢測，評估CPM對NIPT結果的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016-2018年在內蒙古自治區婦幼保健院產前診斷中心經NIPT檢測后，結果提示高風險的孕婦，經產前診斷，在孕婦知情同意的情況下于終止妊娠或足月生產后采集16例胎盤標本。本研究經內蒙古自治區婦幼保健院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1NIPT檢測 抽取孕婦外周靜脈血5 mL，置于cffDNA專用真空采血管(康為世紀)中，分別以1 600×g及16 000×g低溫離心10 min后得到血漿標本。按王杰等[5]報道的方法提取血漿游離DNA并制備文庫，DNA文庫經質控后達到290 bp左右的片段峰值，水平>30 nmol/L。借助于BGI500測序平臺進行測序，利用高分辨率成像系統及生物信息系統轉換得待測序列。所得序列經與人參考基因組GRCh37/hg19比對確定每一測序reads染色體的定位，計算得出標準化Z值。標本滿足質量控制標準(有效數據量≥3.5 Mb，無擴增偏倚，cffDNA比例≥3.5%)時根據標準化Z值評估檢測結果，若Z值的絕對值≥3，提示為高風險；Z值介于-3～<3，結果為低風險。

1.2.2羊水細胞培養及染色體制備 按照實驗室標準流程進行培養、制片、染色等，根據人類細胞基因組學國際命名體系標準(2020)進行核型分析診斷。

1.2.3胎盤組織的采集 孕婦終止妊娠或足月生產后排出胎盤，分別取胎盤邊緣、胎盤中央近胎兒面、胎盤近臍帶根部母體面組織各2 cm×2 cm，浸泡于裝有無菌PBS的離心管中，-80 ℃冰箱保存。

1.2.4FISH檢測 (1)樣品載玻片預處理：羊水細胞經離心、低滲后滴片固定于載玻片，胎盤組織標本剪碎、60%冰乙酸吹打固定于載玻片，固定好的玻片標本經SSC溶液洗滌和胃酶處理，預冷的乙醇溶液固定，將核酸暴露。(2)變性：將玻片和探針分別在變性劑中76 ℃變性。玻片變性后經預冷的乙醇溶液固定，待其干燥后，置于60 ℃烤片機上預熱。(3)雜交：將變性后的探針滴于玻片雜交區，加蓋蓋玻片，封膠，在封閉的濕盒中37 ℃過夜雜交。(4)洗滌：將雜交后的玻片置于變性液中洗滌，洗脫未特異雜交的探針，再用70%乙醇溶液中固定。(5)鏡檢：將洗滌后的玻片經DAPI復染劑染色，在熒光顯微鏡下鏡檢。(6)結果判讀：鏡下進行細胞計數。每個雜交區至少計數50個信號強且無重疊的雜交細胞。如果超過90%的細胞顯示非整倍信號，則判斷為非整倍體；如果10%～60%的細胞顯示非整倍體信號，則可能為嵌合體；如果信號差無法確定則加大細胞計數至100個。所有標本均在盲法設計下，與染色體核型分析比較。

1.2.5CMA檢測 應用Affymetrix公司的CytoScan HD全基因芯片掃描技術檢測全基因組拷貝數變異(CNVs)。標本依次進行PCR擴增、提純、定量、片段化處理，再將DNA溶液標記后加入雜交試劑孵育，載入到芯片中進行雜交反應；洗染芯片后用Affymetrix GeneChip Scaner掃描分析，通過AGCC軟件芯片圖像顯示分析生成原始cel文件，并利用CHAS軟件分析結果[5]。檢測到的CNVs與基因組數據(GRCh37/hg19)進行比對，借助于UCSC、DECIPHER、ISCA CNVs多態性數據庫、既往文獻及在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM)，對其臨床意義進行系統的評估和判斷，并按照人類細胞基因組學國際命名體系標準(ISCN2020)進行結果描述。

2 結 果

2.1NIPT高風險產前診斷、胎盤檢測結果 16例NIPT高風險且采集到胎盤的研究標本包含21-三體高風險13例，經產前診斷后12例與NIPT結果一致，引產后對胎盤組織進行FISH/CMA檢測，結果與NIPT一致。1例產前診斷后胎兒染色體核型未見異常(標本1)，與NIPT檢測結果不一致；NIPT提示18-三體高風險2例，經產前診斷及胎盤檢測后均與NIPT結果一致；NIPT提示 6號染色體三體高風險1例(標本2)，抽取羊水進行CMA產前診斷后結果提示胎兒16號染色體存在部分缺失：arr[GRCh37]16p13.11(14892975_16528123)×1，與NIPT檢測結果不一致，該區域覆蓋了16p13.11微缺失綜合征的全部區域。

經統計，NIPT結果與產前診斷結果的一致率為87.5%(14/16)，與胎盤檢測結果的一致率為93.8%(15/16)。其中NIPT提示21-三體高風險與產前診斷結果的一致率為92.3%(12/13)，與胎盤檢測結果的一致率為100.0%(13/13)；NIPT提示18-三體高風險與產前診斷結果的一致率為100.0%(2/2)，與胎盤檢測的一致率為100.0%(2/2)；NIPT提示6號染色體三體高風險與產前診斷檢測、胎盤檢測結果均存在偏差。

2.22例NIPT假陽性標本胎盤檢測及孕期回顧性分析 2例標本NIPT假陽性標本，分別在生育或引產后取胎盤組織進行CMA檢測。其中，標本1孕婦(24歲)NIPT提示21-三體高風險，孕期經羊水核型分析檢測胎兒核型未見異常(46，XN)。足月分娩后，胎盤多點CMA檢測存在不同比例的嵌合，胎盤邊緣區域檢測結果為arr(21)×3[0.4]；胎盤中央近胎兒面為arr(21)×3[0.33]；胎盤近臍帶根部母體面為arr(21)×3[0.25]。對其孕期情況進行回顧分析，該孕婦孕期平順，超聲影像學檢測胎兒生長發育未見明顯異常。足月擇期子宮下段剖宮產術終止妊娠，產一男嬰，新生兒出生體質量3.2 kg，外觀無明顯畸形。

標本2孕婦(32歲)NIPT提示6號染色體三體高風險，經羊水CMA基因芯片檢測后提示胎兒16號染色體存在部分缺失：arr[GRCh37]16p13.11(14892975_16528123)×1。引產后留取胎盤組織經CMA檢測后提示存在6號染色體三體嵌合與16p13.11區域部分缺失，其中胎盤邊緣區為arr(6)×3[0.25]；胎盤中央近胎兒面區為arr[GRCh37](6)×3[0.52],16p13.11(14892975_16528123)×1；胎盤近臍帶根部母體面為arr(6)×3[0.4]。對其孕期情況進行回顧，孕早期胎兒頸項透明層(NT)超聲檢測未見異常,但孕中期出現胎兒宮內生長受限，影像學檢查提示胎兒雙頂徑頭圍相當于25+5周，腹圍相當于24周，股骨、肱骨相當于22+5周，23+3周時，股骨肱骨<2s，雙側腎盂分離，分別為左側寬0.53 cm、右側寬0.51 cm(圖1)。引產后，胎兒外觀無其他明顯畸形。孕婦及其配偶進行外周血CMA分析，未見異常。

圖1 標本2胎兒雙腎超聲橫切面圖

3 討 論

NIPT技術自開展以來在全世界范圍內得到了廣泛的使用，盡管得到了很高的認可，但是它仍然是一項篩查技術，還不能完全取代產前診斷技術。影響NIPT結果的原因主要來源于母體因素或者胎兒因素，母體因素包括母體本身染色體異常、惡性腫瘤、移植男性器官、組織，胎兒因素包括cffDNA偏低、胎盤嵌合體及雙胎之一消失[1]。由于NIPT技術主要檢測的是母體血漿中cffDNA，而cffDNA主要來源于胎盤絨毛外層凋亡的滋養層細胞，進入母親外周血液循環，因此胎盤嵌合體會直接影響NIPT結果。

在CPM中胎盤多同時存在兩種或多種細胞系，其染色體核型與胎兒存在差異，此時胎兒染色體核型大多正常，這種情況就會導致NIPT假陽性[1,6]。GRATI等[7]對52 673例CVS標本的回顧性分析發現，在不同胎盤嵌合類型中都會存在一定比例的13-三體、18-三體和21-三體。隨著大家研究的深入，CPM對NIPT檢測影響的病例陸續增加。謝潤桂等[8]對86例NIPT假陽性病例進行母血和胎盤的檢測，得出胎盤和母血中異常的游離DNA釋放是NIPT假陽性的主要原因。高雅等[9]報道了1例由于21-三體CPM造成的NIPT假陽性，同時指出羊水穿刺過程中胎盤或胎盤滋養層細胞污染可能引起產前診斷的假陽性。李萌萌等[10]也報道1例由于胎盤存在2-三體、7-三體及21-三體嵌合引起NIPT假陽性的案例，該孕婦在28周時出現胎兒宮內生長發育遲緩，孕婦本人于37周出現子癇的表現。本研究通過對羊水細胞和胎盤組織的檢測，發現NIPT結果與產前診斷的一致率為87.5%，但是與胎盤檢測結果的一致率可達93.8%。其中NIPT提示的21-三體的高風險與產前診斷結果的一致率為92.3%(12/13)，胎盤檢測與NIPT結果的一致率為100.0%(13/13)；18-三體的產前診斷與NIPT結果的一致率為100.0%(2/2)，胎盤檢測與NIPT結果的一致率為100.0%(2/2)；6號染色體三體的產前診斷檢測、胎盤檢測與NIPT結果均存在偏差。

本研究有2例NIPT假陽性標本。其中標本1 NIPT提示21-三體高風險，產前診斷后胎兒染色體核型未見異常。該孕婦孕期平順，超聲影像學檢測胎兒生長發育未見明顯異常。后足月擇期子宮下段剖宮產術終止妊娠，產一男嬰，新生兒出生體質量3.2 kg，外觀無明顯畸形。胎兒出生后多點胎盤檢測后存在不同比例的21-三體嵌合。標本2 NIPT提示 6號染色體三體高風險，抽取羊水進行CMA產前診斷，提示胎兒存在16p13.11部分缺失。已報道攜帶有相同片段缺失的患者主要表現包括中度/重度智力障礙、癲癇、發育遲緩、前腦無裂畸形、小頭畸形、特殊面容、拇指外翻等[11]。本例受檢者在孕中期出現胎兒宮內生長受限，影像學檢查提示胎兒雙頂徑頭圍相當于25+5周，腹圍相當于24周，股骨、肱骨相當于22+5周，23+3周時，股骨肱骨<2s，雙側腎盂分離，分別為左側寬0.53 cm、右側寬0.51 cm。孕婦充分知情，被告之后選擇引產，引產后取胎盤組織進行CMA檢測，結果提示6號染色體三體嵌合與16p13.11存在1.36M部分缺失。2例經產前診斷結果顯示NIPT假陽性，胎兒染色體核型和胎盤結果不一致。標本2孕婦的胎盤多點標本CMA檢測為6號染色體三體與16號染色體微缺失的嵌合，與胎兒的染色體核型結果不一致，證實本例孕婦胎盤存在CPM。該孕婦在孕25周出現胎兒生長受限，推測是CPM導致的[12-14]。標本1孕婦胎兒孕期生長發育良好，可能是由于胎盤中異常細胞比例較低，對胎兒血液供應影響較小所致。進一步說明CPM是引起NIPT結果與產前診斷結果不一致的重要原因，因此對于NIPT高風險的孕婦建議通過侵入性診斷來進一步明確診斷，不能單純基于NIPT結果來決定終止妊娠。

綜上所述，由于NIPT檢測存在假陽性及假陰性等局限性，對于高風險的孕婦需進行產前診斷以明確診斷。對于檢測結果高度提示為CPM的孕婦，妊娠期應加強對胎兒在宮內發育情況的監測，當出現胎兒生長受限時，對臍動脈血流及大腦中動脈血流進行檢測，并在后續分娩時留取胎盤標本，以明確胎盤染色體核型的診斷。