胰腺導管腺癌組織中miR-27、E2F7的表達及臨床意義*

張武超,寇學斌△,許春進,舒閃閃

1.新鄉醫學院附屬商丘市第一人民醫院消化內科,河南商丘 476000；2.河南省商丘市婦幼保健院檢驗科,河南商丘 476003

胰腺癌是高度惡性的消化系統惡性腫瘤，全球每年發病人數達33.8萬，死亡人數達33.1萬，病死率極高，預后極差，5年總體生存率(OS)約為8%[1]。胰腺癌病理類型包括胰腺導管腺癌、腺鱗癌及多形性癌等。胰腺導管腺癌是最常見的病理類型，目前臨床上的治療方法有手術、化療及生物治療等，但胰腺癌患者早期無典型的臨床表現，一經確診已為晚期，失去最佳的治療機會[2]。近年來分子生物學的發展，為胰腺導管腺癌的臨床診斷及治療提供新的方向。微小RNA(miR)是長度為18～25個核苷酸的RNA分子，本身不具有編碼蛋白的功能，能與靶基因mRNA的3′非翻譯(UTR) 區結合，降低 mRNA的穩定性，影響靶基因轉錄[3]。miR-27基因位于人類染色體19p13.12，研究發現，肝癌[4]、結直腸癌[5]等腫瘤中存在miR-27異常表達下調的現象，其作為一種抑癌基因，能夠抑制下游癌基因K-ras的表達，發揮抑制腫瘤細胞增殖和轉移的作用,而其表達下調參與促進腫瘤的發生、發展。E2F轉錄因子7(E2F7)編碼基因位于12q21.2，該基因編碼E2F7蛋白，屬于E2F轉錄因子家族成員，調節哺乳動物細胞增殖、分化和凋亡等生物學過程。研究表明，E2F7在宮頸癌[6]、肝癌[7]等惡性腫瘤中發揮致癌基因的功能，其促進腫瘤細胞G1/S期的轉換，導致腫瘤細胞的無限增殖，促進腫瘤進展。范源等[8]研究表明，細胞中miR-27的表達下調伴隨著E2F7的上調，而敲低miR-27則促進E2F7的表達，因而miR-27和E2F7可能存在負反饋回路，影響腫瘤的發生、發展。本研究通過研究miR-27和E2F7在胰腺導管腺癌中的表達，探討miR-27和E2F7的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年1月在在新鄉醫學院附屬商丘市第一人民醫院診治的93例胰腺導管腺癌患者的資料。納入標準：(1)經病理學檢查確診為胰腺導管腺癌；(2)初次診治，無化療、放療病史；(3)患者能夠配合隨訪，隨訪資料完整。排除標準：(1)合并胃腸道感染性疾??；(2)有其他惡性腫瘤病史；(3)合并心、肺、腎等臟器功能障礙。93例胰腺導管腺癌患者中男52例，女41例；年齡38～75歲，平均(51.23±6.1)歲，≤60歲40例，>60歲53例；腫瘤分期：Ⅰ期34例，Ⅱ～Ⅲ期59例；病理分級：高分化30例，中低分化63例；腫瘤最大徑：≤2 cm 52例，>2 cm 41例；腫瘤位置：胰頭51例，胰體、胰尾42例；伴淋巴結轉移44例，無淋巴結轉移49例。所有患者自確診之日起開始隨訪，以電話方式隨訪，每個月進行一次隨訪，隨訪內容為患者生存情況，隨訪時間截止至2020年2月，隨訪終點為患者死亡或隨訪結束。本研究經新鄉醫學院附屬商丘市第一人民醫院倫理委員會審核批準。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR(qPCR)檢測miR-27、E2F7基因的表達 收集新鮮獲取(術中獲取標本，標本離體30 min以內)的癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣0.5 cm以上)，-80 ℃保存。應用Trizol提取癌組織及癌旁組織中的RNA，Narodrop檢測RNA水平。以組織中RNA為模板，進行反轉錄，形成cDNA，進行qPCR檢測。miR-27引物正向序列：5′-TGGTGGCAGTAGAGGCTATG-3′，反向序列：5′-AGTCCAGGCCAGTATGTTAC-3′；內參U6正向序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向序列:3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。E2F7正向序列:5′-AATGCAGTGGTTGTTTCTGT-3′，反向序列:5′-TGCCATTGCTTCTTCACTAC-3′；內參GAPDH正向序列:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，反向序列:5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。總體系20 μL：cDNA 1 μL，Taq聚合酶0.2 μL、上下游引物各1 μL、SYBR Greenpremix 10 μL及1 μL濃度為20 mmol/L的dNTPs，DEPC水5.8 μL。qPCR反應條件：50 ℃活化2 min，95 ℃ 預變性2 min，95 ℃ 變性15 s，60 ℃ 退火32 s，70 ℃延伸10 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-27、E2F7 mRNA的相對表達水平。

1.2.2免疫印跡檢測組織中E2F7蛋白表達 將50 mg的癌組織及癌旁組織冰上研磨，加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，裂解0.5 h，提取組織蛋白。蛋白BCA法定量后，加SDS上樣緩沖液，95 ℃金屬浴煮樣10 min。SDS-PAGE 膠電泳：濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓130 V，然后進行濕轉法轉膜，恒流250 mA轉印90 min。將PVDF 膜放入5%脫脂奶中封閉2 h，TBST洗3遍，每次5 min，一抗4 ℃孵育過夜(E2F7單克隆抗體購自Abcam，貨號：56022)，二抗室溫孵育1 h。ECL暗室顯影照相。

2 結 果

2.1組織中miR-27、E2F7的表達 癌組織中miR-27的相對表達水平為0.425±0.081，在癌旁組織中為1.370±0.225，癌組織中miR-27的相對表達水平明顯低于癌旁組織(t=38.109，P<0.001)；癌組織中E2F7基因的相對表達水平為1.755±0.306，在癌旁組織中為0.317±0.094，癌組織中E2F7基因的相對表達水平明顯高于癌旁組織(t=43.321，P<0.001)，見圖1A。免疫印跡結果顯示，E2F7蛋白在癌組織和癌旁組織中的相對灰度值分別為2.147±0.421、0.308±0.019，癌組織中E2F7蛋白相對灰度值明顯高于癌旁組織(t=42.082,P<0.001)。見圖1B。以癌組織中miR-27相對表達水平的均值0.425為界，miR-27高表達組45例，miR-27低表達組48例；以癌組織中E2F7基因相對表達水平的均值1.755為界，E2F7基因高表達組44例，E2F7基因低表達組49例。

2.2癌組織中miR-27、E2F7基因的表達的相關性及相互作用預測 Pearson線性相關分析結果，癌組織中miR-27與E2F7基因的相對表達水平呈負相關(r=-0.612，P<0.001)，見圖2。采用TargetScan Human7.2在線軟件(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測miR-27與E2F7基因的結合位點，結果顯示E2F7基因的3′非編碼區第788～795個堿基存在與miR-27相互作用的位點，見圖3。

注：A表示癌組織與癌旁組織中miR-27與E2F7 mRNA相對表達水平比較；B表示癌組織與癌旁組織E2F7蛋白表達比較。N1為病例1癌旁組織，C1為病例1癌組織；N2病例2癌旁組織，C2為病例2癌組織。

圖2 癌組織中miR-27與E2F7基因表達的相關性

圖3 生物信息學在線軟件預測miR-27與 E2F7基因的結合位點

2.3癌組織中miR-27、E2F7基因的相對表達水平與臨床病理特征的關系 不同腫瘤TNM分期、有或無淋巴結轉移的胰腺導管腺癌患者癌組織中miR-27與E2F7基因相對表達水平差異均有統計學意義(P<0.05)，而不同性別、年齡、病理分級、腫瘤最大徑、腫瘤位置的患者癌組織中miR-27與E2F7基因相對表達水平差異均無統計學意義(P>0.05)。Ⅱ～Ⅲ期、有淋巴結轉移的患者癌組織中miR-27的相對表達水平均明顯低于Ⅰ期、無淋巴結轉移的患者(P<0.05)；Ⅱ～Ⅲ期、有淋巴結轉移的患者癌組織中E2F7基因相對表達水平均明顯高于Ⅰ期、無淋巴結轉移的患者(P<0.05)，見表1。

表1 癌組織中miR-27、E2F7基因相對表達水平與患者臨床病理特征的關系

2.4癌組織中miR-27與E2F7基因的不同表達與患者預后的關系 所有患者出院后隨訪2～12個月，中位隨訪時間7個月，隨訪結束時死亡62例，1年OS為33.3%(31/93)。miR-27高表達組及低表達組患者的1年OS分別為51.1%(23/45)、16.7%(8/48)，miR-27低表達組患者1年OS明顯低于高表達組患者(χ2=5.129，P=0.015)。E2F7基因高表達組及低表達組患者的1年OS分別為13.6%(6/44)、51.0%(25/49)，E2F7基因高表達組患者1年OS明顯低于低表達組患者(χ2=6.514，P=0.002)，見圖4。

圖4 miR-27、E2F7基因不同表達患者的預后比較

3 討 論

目前胰腺導管腺癌的病死率高，該病病因及發病機制尚不清楚[9]。目前認為，遺傳因素、環境因素等引起的分子遺傳學改變是胰腺導管腺癌發生、發展的重要機制，大量癌基因的激活或(和)抑癌基因的失活，促進了腫瘤的惡性進展[10]。深入探討胰腺導管腺癌發生、發展的機制，對于尋找新的診斷治療方案具有重要的臨床價值。

miR-27基因位于人類19號染色體。研究表明，腫瘤中miR-27作為一種抑癌基因，miR-27的表達下調可促進了癌基因ATG10的表達，導致腫瘤的惡性增殖及轉化[11]。本研究發現，癌組織中miR-27的表達水平下調，其機制尚不清楚，可能與長鏈非編碼RNA(LncRNA)對miR-27的表達調控有關。LI等[12]研究表明，LncRNA SNAI3-AS1本身可作為分子支架結合miR-27分子，同時抑制miR-27基因的表達，導致下游癌基因PEG10表達上調，促進腫瘤細胞的增殖及轉移。此外，本研究發現，Ⅱ～Ⅲ期、有淋巴結轉移的患者癌組織中miR-27表達較低，表明miR-27的低表達促進胰腺導管腺癌的惡性進展。其機制可能與miR-27的抑癌基因功能有關。YILMAZ等[13]學者發現，miR-27能夠結合腫瘤中重要的癌基因K-ras mRNA的3′UTR區，抑制K-ras的表達，miR-27表達水平的降低導致K-ras過度激活，促進腫瘤細胞的惡性增殖，導致腫瘤分期升高。此外，有研究發現，血管內皮生長因子(VEGF)是miR-27的直接作用靶點，腫瘤中miR-27的表達下調促進VEGF的分泌，促進腫瘤血管及淋巴管的生成，增強腫瘤細胞的遷移能力，導致淋巴結轉移[14]。本研究中miR-27低表達組患者的1年OS較低，表明胰腺導管腺癌組織中miR-27的低表達與患者的不良預后關系密切，有望成為判斷患者預后的分子指標。

轉錄因子E2F7是促進細胞生長的重要因素，參與調控細胞周期、腫瘤血管生成和DNA的損傷修復等生理學過程。E2F7屬于非典型E2F因子家族成員，包含兩個單獨的DNA結合結構域，通過DNA結合結構域與靶標的啟動子位點結合，促進下游靶基因的表達[15]。有研究表明，E2F7作為一種癌基因，在胃癌、肝癌和頭頸部癌等惡性腫瘤中表達上調，并通過激活c-myc等基因的表達，促進腫瘤的增殖[16]。本研究表明，胰腺導管腺癌組織中E2F7的表達升高，可能與E2F7轉錄后表達調控異常有關。XU 等[17]研究發現，E2F7受到miR-10b的轉錄后表達調控，miR-10b能夠結合E2F7的mRNA，降低E2F7mRNA的穩定性，抑制E2F7的表達，而腫瘤發生時miR-10b的表達水平降低，導致E2F7 的表達上調。本研究中，E2F7基因的表達與較高的腫瘤TNM分期及淋巴結轉移有關，表明E2F7的高表達促進胰腺導管腺癌的惡性進展。其原因可能與E2F7對腫瘤細胞周期的調控有關。有研究表明，E2F7的表達上調能夠通過抑制P53基因介導的凋亡信號傳導通路的傳導，抑制腫瘤凋亡，促進腫瘤惡性增殖，導致分期升高[18]。研究表明，E2F7的水平升高能夠降低細胞基因組的不穩定性，抑制與基因組穩定性有關的基因(如53BP1)的表達，導致DNA損傷修復障礙，促進腫瘤細胞惡性進展[19]。本研究中，E2F7基因高表達的胰腺導管腺癌患者1年OS較低，表明E2F7基因的高表達能反映患者的不良預后。 此外，癌組織中miR-27與E2F7基因的表達呈顯著負相關，本研究同時采用生物信息學預測，結果兩者存在潛在的結合位點，提示E2F7基因可能受到miR-27的轉錄后表達調控。目前胰腺導管腺癌中兩者間的相互作用機制尚不明確，有學者在成肌細胞發現miR-27能夠結合并抑制E2F7的表達，進而抑制細胞的增殖[8]。

綜上所述，胰腺導管腺癌組織中miR-27表達降低，E2F7基因和蛋白表達升高，miR-27與E2F7基因表達呈明顯負相關，且miR-27、E2F7基因的表達與胰腺導管腺癌患者的腫瘤TNM分期及淋巴結轉移有關，癌組織中miR-27低表達及E2F7基因高表達的患者預后較差，兩者有望成為新的胰腺導管腺癌分子標志物，但兩者的作用機制及臨床價值有待深入研究。