鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶和RND外排泵相關(guān)耐藥基因的研究*

周亞玲，陰 晴，王中新△

1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽合肥 230022；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001

近年來，隨著廣譜抗生素的廣泛使用，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(MDRAB)分離率呈逐年上升趨勢(shì)[1]，而其耐藥性的形成與碳青霉烯酶的產(chǎn)生和外排泵過表達(dá)關(guān)系密切[2-3]。碳青霉烯酶中苯唑西林酶是鮑曼不動(dòng)桿菌的主要碳青霉烯酶，特別是OXA-23在其中發(fā)揮主導(dǎo)作用[4-5]。B類金屬酶在各地區(qū)的檢出率存在明顯的差異[6-7]，主要包括blaIMP、blaVIM、blaNDM等基因型。外排泵中的耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化超家族(RND)[8]與MDRAB形成關(guān)系密切，AdeABC、AdeIJK和AdeFGH是其主要類型，其中任何一個(gè)外排泵的過度表達(dá)都會(huì)降低鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性[9]。本研究主要檢測(cè)收集的鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶和RND外排基因的攜帶情況，再應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)測(cè)RND外排泵陽性菌株的adeB、adeJ和adeG表達(dá)水平，為及早識(shí)別耐藥菌以及加強(qiáng)耐藥菌的監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株 所用菌株分離自江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院2016年7月至2018年6月微生物室保存的非重復(fù)性鮑曼不動(dòng)桿菌101株，其中MDRAB71株，非多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(NMDRAB) 30株。參考菌株鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606購于國家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心。

1.2主要儀器 Real-Time PCR儀、普通PCR擴(kuò)增儀和凝膠電泳成像分析系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司；水平電泳套件購自上海天能生物公司；NanoDrop1000分析儀為美國Termo公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋購自嘉興俊思電子有限公司；氣浴恒溫振蕩器購自江蘇科技儀器有限公司。

1.3主要試劑 血瓊脂平購自鄭州安圖生物公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物有限公司；2×qPCR SYBR Green Mix、2×PCR Master Mix、QRT SuperMix for qPCR購自南京Vazyme公司；細(xì)菌總RNA快速抽提試劑盒購自上海生工生物公司；DNA Marker購自大連寶生物公司；PCR引物由無錫天霖生物科技有限公司合成；瓊脂糖粉末購自西班牙Biowest公司。

1.4方法

1.4.1細(xì)菌DNA模板的制備 采用煮沸裂解法制備細(xì)菌總DNA，操作步驟為血平板復(fù)蘇-80 ℃保存的菌株，置CO2恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日用無菌接種環(huán)挑取3～5個(gè)菌落接種于300 μL滅菌蒸餾水中并振蕩混勻，100 ℃煮沸10 min裂解細(xì)菌， 12 000 r/min離心10 min后收集上清液即為DNA模板。

1.4.2碳青霉烯酶基因的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[6,10]合成檢測(cè)引物，具體序列見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括預(yù)混液 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，51～56 ℃退火30 s，具體退火溫度見表1，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.4.3RND外排泵基因的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[9,11]合成檢測(cè)引物，具體序列見表1。PCR反應(yīng)體系同1.4.2。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，53～55 ℃退火30 s，具體退火溫度見表1，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

表1 碳青霉烯酶基因和RND外排泵基因引物序列

1.4.4qPCR檢測(cè)外排泵基因adeB、adeJ和adeG的表達(dá)水平 在adeB、adeJ和adeG同時(shí)陽性的菌株中隨機(jī)選取6株MDRAB和4株NMDRAB進(jìn)行qPCR檢測(cè)，ATCC19606作為參考菌株。血平板復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)菌株，置CO2恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑單個(gè)菌落于3 mL的LB液體培養(yǎng)基中，置恒溫?fù)u床上37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h后收集菌體，采用RNA快速抽提試劑盒提取細(xì)菌總RNA，RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用于后續(xù)qPCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性8 min、95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s，反應(yīng)共40個(gè)循環(huán)，于退火階段收集熒光信號(hào)，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次。計(jì)算平均Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算被測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

續(xù)表1 碳青霉烯酶基因和RND外排泵基因引物序列

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)MDRAB與NMDRAB的blaNDM-1、blaIMP、blaOXA-23、adeB、adeJ和adeG基因攜帶率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；對(duì)MDRAB與NMDRAB的adeB、adeJ和adeG基因的表達(dá)水平進(jìn)行t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1碳青霉烯酶基因的PCR結(jié)果 71株MDRAB中blaNDM-1(26.8%，19/71)、blaIMP(88.7%，63/71)和blaOXA-23(84.5%，60/71)的檢出率明顯高于30株NMDRAB中blaNDM-1(0.0%，0/30)、blaIMP(0.0%，0/30)和blaOXA-23(10.0%，3/30)的檢出率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。blaOXA-51的檢出率均為100.0%，未檢測(cè)到blaVIM、blaOXA-24和blaOXA-58，具體電泳結(jié)果見圖1。

注：M為DL2000marker，blaNDM-1為316 bp，blaIMP為449 bp，blaOXA-23為501 bp，blaOXA-51為352 bp。

2.2RND外排泵基因的PCR檢測(cè)結(jié)果 71株MDRAB中adeB(98.6%，70/71)和adeG(100.0%，71/71)的檢出率明顯高于30株NMDRAB中adeB(20.0%，6/30)和adeG(90.0%，27/30)的檢出率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；adeJ的檢出率均為100.0%。具體電泳結(jié)果見圖2。

2.3adeB、adeJ和adeG的表達(dá)水平 qPCR結(jié)果顯示：MDRAB菌株adeB、adeG和adeJ的平均相對(duì)表達(dá)量分別為7.78±2.19、5.31±1.13和1.55±0.38；NMDRAB菌株的adeB、adeG和adeJ的平均相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.41、0.46±0.23、1.84±0.13；MDRAB菌株的adeB、adeG和adeJ的相對(duì)表達(dá)量分別是NMDRAB菌株的14.91倍、11.61、0.84倍，可見MDRAB菌株的adeB、adeG的相對(duì)表達(dá)量明顯高于NMDRAB菌株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；adeJ的相對(duì)表達(dá)量在MDRAB和NMRAB菌株之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：M為DL2000marker，adeB為901 bp，adeJ為222 bp，adeG為236 bp。

注：*P<0.05。

3 討 論

MDRAB感染具有高發(fā)病率和高致死率，一直廣受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，而碳青霉烯酶基因和外排泵高表達(dá)是MDRAB形成的主要機(jī)制。

本次收集的所有菌株均檢測(cè)到blaOXA-51。早在2005年，HERITIER等[12]發(fā)現(xiàn)blaOXA-51位于鮑曼不動(dòng)桿菌染色體上。STRATEVA等[13]也發(fā)現(xiàn)收集的226株鮑曼不動(dòng)桿菌均攜帶blaOXA-51，證實(shí)了上述結(jié)果。blaOXA-23在本次收集的MDRAB中攜帶率高達(dá)84.5%，其余苯唑西林酶未被檢測(cè)到，表明blaOXA-23是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要水解酶，這一結(jié)果與國內(nèi)外研究結(jié)果相符[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)有3株對(duì)碳青酶烯類藥物敏感的NMDRAB卻檢測(cè)到blaOXA-23基因，考慮到這3株NDMRAB攜帶的blaOXA-23基因上游可能缺乏插入序列ISAbal或者插入序列發(fā)生突變，ISAbal的出現(xiàn)可以上調(diào)blaOXA基因的表達(dá)，從而有效增強(qiáng)抗菌藥物的水解作用，導(dǎo)致耐藥的出現(xiàn)[14]。對(duì)金屬酶的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，blaNDM-1和blaIMP基因均存在于MDRAB中，blaNDM-1的檢出率(26.8%，19/71)與陳嬌等[15]報(bào)道的結(jié)果相符(26.56%，17/64)，低于閆玲等[16]報(bào)道的33.33%(14/42)，但是高于TADA等[17]報(bào)道的18.52%。blaIMP的檢出率與江蘇徐州地區(qū)報(bào)道的86.88%相符[6]，明顯高于皖北地區(qū)報(bào)道的14.3%[18]。在所收集的菌株中未檢測(cè)到blaVIM基因，表明blaVIM不是江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院MDRAB形成的主要水解酶。本次研究的金屬酶陽性率總體處于偏高的水平，應(yīng)引起高度重視。

MDRAB的另一個(gè)重要耐藥機(jī)制是外排基因的過度表達(dá)，外排泵具有廣泛的底物特異性，可以將多種抗菌藥物排出體外，降低藥物抑菌或殺菌作用。RND外排泵在鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥中扮演著至關(guān)重要的角色，在其賦予菌株耐藥表型的同時(shí)，也增強(qiáng)菌株獲得其他耐藥機(jī)制，比如抗菌藥物作用靶點(diǎn)的突變、水解酶的產(chǎn)生等[5]。目前RND家族主要包括adeABC、adeIJK、adeFGH、adeDE、adeXYZ，后兩種研究較少。本研究通過PCR檢測(cè)adeB、adeG、adeJ基因來分析外排泵基因adeABC、adeIJK、adeFGH在鮑曼不動(dòng)桿菌中的分布情況，發(fā)現(xiàn)外排泵基因adeB主要分布在MDRAB中，而外排泵基因adeJ、adeG不僅分布在MDRAB中，在NMDRAB中也廣泛分布。因此筆者進(jìn)一步應(yīng)用qPCR檢測(cè)adeB、adeG、adeJ的表達(dá)，結(jié)果顯示MDRAB的adeB、adeG表達(dá)水平明顯高于NMDRAB，表明adeABC、adeFGH的高表達(dá)是江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院MDRAB形成的一個(gè)重要機(jī)制。另外，本次研究發(fā)現(xiàn)，所有菌株均攜帶adeJ。早在2008年DAMIER-PIOLLE 等[19]報(bào)道60株鮑曼不動(dòng)桿菌均檢測(cè)到adeIJK基因，并且證實(shí)adeIJK復(fù)合體是鮑曼不動(dòng)桿菌固有基因，而不是獲得性的。本研究結(jié)果與該研究一致。

綜上所述，碳青霉烯酶的產(chǎn)生以及RND外排泵基因的高表達(dá)在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院MDRAB耐藥機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用，通過對(duì)耐藥機(jī)制的深入研究有助于及早識(shí)別耐藥菌以及為控制多重耐藥菌株的形成和醫(yī)院內(nèi)播散提供理論依據(jù)。