樹鼩自發性乳腺癌的代謝組學分析*

石倩倩，敖青青，韋蘭成，郭松超,，唐 深，李習藝，歐陽軼強，陸彩玲△

（廣西醫科大學 1.公共衛生學院；2.基礎醫學院；3.實驗動物中心，南寧 530021）

乳腺癌是一類常見嚴重危害女性健康的高度異質性腫瘤，是女性癌癥死亡的主要原因。據統計，我國乳腺癌發病率逐年上升，現已居女性惡性腫瘤發病的首位，且發病越來越年輕化[1-2]。乳腺癌的發生發展受諸多因素影響。建立適宜的乳腺癌動物模型，有助于整體研究乳腺癌的發生發展，對乳腺癌的防治具有重要意義。樹鼩是一種新興的實驗動物，其全基因組測序結果與靈長類動物具有高度同源性，在諸多方面（如：生理代謝、免疫、遺傳等）與人類具有較高的相似性[3]。近年來，樹鼩廣泛的應用于乳腺癌動物模型，并取得一定的進展[4-5]。代謝組學是對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化相對關系的研究方法。大量的研究顯示，在乳腺癌的發生發展過程中，機體的代謝也隨著發生變化，這些代謝物質可以成為新潛在的篩查和診斷乳腺癌的方法標志物[6-7]。但近年來，在乳腺癌的研究中，以樹鼩為動物模型且運用代謝組學技術分析的研究卻鮮有報道。因而，在本研究中，我們通過構建樹鼩乳腺癌模型，采用GC-TOFMS 技術，檢測自發乳腺癌樹鼩血清代謝物的變化，從代謝組學角度闡述其代謝產物的變化特征，為進一步探究乳腺癌發病的潛在生物標志物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年雌性樹鼩（4 月齡及以上）50只，健康未育，體重（130±10）g，由中國科學院昆明動物研究所提供（實驗動物生產許可證：SCXK（滇）K2016-0002）。飼養于廣西醫科大學普通級動物飼養室（實驗動使用許可證：SYXK 桂2020-0004），喂飼樹鼩專用的全價飼料，自由飲水。飼養室保持溫度20～25 ℃，濕度30%～60%，每日清潔2次。實驗動物的處理方法均經廣西醫科大學實驗動物倫理委員會批準（批準文號:201804054）。

1.2 主要試劑 甲醇（CNW Technologies，德國），氯仿及吡啶（上海阿達瑪斯有限公司），L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司），飽和脂肪酸甲酯（Dr.Ehrenstorfer，德國）。

1.3 樣本采集與制備 觀察記錄各組樹鼩的體重及體長等基礎信息，實驗觀察期限為24個月。實驗觀察期限結束后，從自發發生乳腺癌的樹鼩中選取7 例病理組織學鑒定確診為乳腺癌的為模型組（T組），同時選取12 例為未發生乳腺癌的健康樹鼩為對照組（C 組）。對樹鼩進行采血1～1.5 mL 放入無抗凝劑離心管中，放置4 ℃冰箱2 h，4 ℃離心取上層血清分裝于1.5 mL 離心管中，放置-80 ℃超低溫冰箱保存待檢。

1.4 血清代謝組學分析

1.4.1 樣品前處理 血清樣本解凍后，取樣本50 μL于1.5 mL EP管中，加入200 μL預冷提取液甲醇，再加入5 μL L-2-氯苯丙氨酸，渦旋30 s 后超聲10 min（冰水浴）；將其放入4 ℃離心機離心（12 000 rpm/15 min）；隨后小心移取上清液于EP 管中并在真空濃縮器中干燥（每個樣本各取30 μL混合成QC樣本）；后加入30 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵育30 min；加入40 μL BSTFA（含有1% TMCS，v/v），將混合物70 ℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，向混合的樣本中加入5 μL FAMEs（溶于氯仿）；隨機順序上機檢測。

1.4.2 儀器設置和進樣分析 使用氣相色譜儀—飛行時間質譜儀對樣本進行檢測分析。具體參數如下：系統色譜柱采用DB-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）自動進樣，進樣體積為1 μL。以氦氣作為載氣，前部入口吹掃流量為3 mL min-1，通過色譜柱的氣體流速為1 mL min-1。初始溫度保持在50 ℃下1 min，再以20 ℃min-1的速率升至310℃，最后在310℃下保持6 min。質譜接口、傳輸線和離子源溫度分別為280 ℃、280 ℃和250 ℃。采用EI 源，碰撞電壓設置為70 eV質譜，全掃描模式（M/Z 50-500），掃描速度為12.5 spectra/s。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示。代謝組學數據使用SIMCA軟件（V15.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea，Sweden）進行分析。檢測所得的代謝物采用正交偏最小二乘法—判別分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA）；差異代謝物篩選卡值標準為t檢驗的P值＜0.05，同時OPLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）＞1。使用京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、MetaboAnalyst分析出相應的代謝通路。

2 結果

2.1 樹鼩的基本情況 到觀察結束時，C組樹鼩體重為（123.65±10.54）g，體長為（17.73±0.65）cm；T 組樹鼩體重為（118.6±19.44）g，體長為（17.07±0.19）cm，腫瘤質量為（0.75±0.66）g。

2.2 各組樹鼩總離子流圖 通過GC-TOFMS分析研究兩組間血清樣品的代謝物圖譜，從血清樣本中提取了493 個峰，經過進一步的處理，最后確定了451 個特征峰。如圖1 所示，可看出樣品出峰均勻，強度適中，適宜T組與C組的血清樣品分析。在色譜質譜聯用儀檢測中，QC 樣本可用于評價其系統的穩定性，QC 樣本相關性越接近于1（應≥0.7），表明模型穩定性越好數據質量越高，見圖2。

圖1 兩組樹鼩血清的總離子流圖

圖2 QC樣本相關性分析圖

2.3 OPLS-DA 分析 OPLS-DA 得分圖（圖3A）說明，兩組血清樣本區分非常顯著，且幾乎處于95%置信區間內。置換檢驗結果（圖3B）說明構建的OPLS-DA模型符合真實情況，無擬合過度現象。

圖3 OPLS-DA得分圖和OPLS-DA模型的置換檢驗結果圖

2.4 差異代謝物的篩選 通過SIMCA-V15.0.2 進行分析，以OPLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度（VIP）＞1 及P＜0.05，篩選出的結果見圖4A。通過對篩選出的差異代謝物進行定性，共定性到32種差異代謝物，其中14種已知（表1）。與正常對照組相比，自發乳腺癌組中有13種下調，1種上調（圖4B）。

表1 樹鼩自發乳腺癌關鍵差異代謝產物

圖4 差異代謝物篩選火山圖和層次聚類分析結果熱力圖

2.5 差異代謝物的代謝通路分析 對篩選出的14種差異代謝物經MetaboAnalyst通路富集分析，確定正常對照組與自發乳腺癌組的差異代謝物相關的生物學途徑（圖5），通路影響值提示，精氨酸和脯氨酸代謝、花生四烯酸代謝通路與樹鼩自發乳腺癌代謝調節的作用機制密切相關。對上述代謝物參與的代謝途徑進行整合分析，通過KEGG數據庫處理上述代謝的代謝過程，得到4 種標志性差異代謝產物通路，歸屬結果見表2。

圖5 代謝通路氣泡圖

表2 4種差異代謝產物代謝通路歸屬

3 討論

本研究對19 只納入時體重及體長等無差別的樹鼩進行了24個月的觀察，至觀察結束，7只樹鼩先后自發了乳腺癌。進一步地，采用GC-TOFMS比較了正常樹鼩與自發乳腺癌樹鼩中血清代謝物的差異，通過生物信息學技術分析差異代謝物，確定血清中脯氨酸、羥脯氨酸、肌酸以及花生四烯酸存在差異，極有可能參與樹鼩乳腺癌的自發過程。

脯氨酸為環狀α-亞氨基酸，是合成人體蛋白質的重要氨基酸之一。其在蛋白合成、機體的新陳代謝、抗氧化及免疫反應等方面發揮著重要的調控作用。羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）是一種非必需氨基酸，主要存在于膠原組織中，是構成膠原的重要成分之一，可由脯氨酸轉變而成。羥脯氨酸作為膠原蛋白中的特異性氨基酸，可以反映機體中膠原蛋白含量的變化，而膠原蛋白含量變化又與許多疾病有關（如燒傷、肝硬化、腫瘤等）。腫瘤細胞快速增殖往往需要大量的氨基酸，并以此維持旺盛的蛋白合成和能量供給[8]。本研究乳腺癌組血清中的脯氨酸及羥脯氨酸水平低于正常組，可能是乳腺癌細胞代謝旺盛，攝取并消耗機體脯氨酸及羥脯氨酸致血清中的豐度降低。與人類乳腺癌研究中也有脯氨酸及羥脯氨酸下降的報道一致[9]。

肌酸是一種含氮的有機酸，可快速為細胞提供能量。隨著腫瘤的生長，腫瘤體積增加，癌細胞快速無限增殖，所需的能量也隨著增加，需要大量的三磷酸腺苷（ATP）參與。但在機體內ATP的存儲量較少，且合成速度較慢。本實驗乳腺癌組組中肌酸含量出現顯著下調，可能是癌細胞的增殖需要消耗大量的肌酸以合成ATP。在人乳腺癌患者血漿代謝組學中，肌酸在癌癥患者血漿中也表現為降低[8]。同時，在患乳腺癌貓血清的代謝組學研究中，也有肌酸降低的報道[10]。

花生四烯酸（arachidonic acid，AA）是n-6 系列多不飽和脂肪酸中重要的脂肪酸，對哺乳動物而言是必需的。花生四烯酸在生物體內主要是以磷脂的形式存在于細胞膜上，在磷脂酶A2和磷脂酶C的作用下分解釋放為游離的AA，且轉變為具有生物活性的代謝產物，并與腫瘤的發生發展密切相關[9]。本研究結果顯示，相較于對照組，自發乳腺癌組中的花生四烯酸水平明顯降低，與文獻報道一致[11]。AA能刺激鞘磷脂轉變為神經酰胺，誘導細胞凋亡，從而達到抑制腫瘤生長的目的[12]。本研究中乳腺癌組的花生四烯酸含量低于正常組，可能有助于腫瘤細胞生長。

綜上所述，脯氨酸、羥基脯氨酸、花生四烯酸和肌酸的改變與樹鼩自發乳腺癌的發生與發展密切相關。這些差異代謝物表明，樹鼩乳腺癌發生過程中，機體代謝變化涉及了花生四烯酸及精氨酸、脯氨酸代謝途徑。差異代謝物在乳腺癌發生發展中的確切機制有待進一步探索。