外周血白細胞綠色包涵體合并瘧色素病例臨床回顧分析

郭 平， 常菁華， 王劍飚

（1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗科，上海 200025；2.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院藥劑科，上海 200025）

瘧疾是一種由瘧原蟲感染引起的寄生蟲病。人體感染瘧原蟲后初期癥狀往往不典型，可出現發熱、頭痛、胃腸道不適和肌肉酸痛等癥狀，類似病毒感染；重癥患者可出現黃疸、意識模糊、癲癇等癥狀。多數患者及時治療后癥狀可迅速消退，但未及時接受救治者可能因腦型瘧疾、瘧疾性貧血等嚴重并發癥導致昏迷，甚至死亡[1]。中性粒細胞和/或單核細胞中的綠色包涵體是一類在外周血涂片中罕見的白細胞形態學變化，既往報道主要見于急性肝衰竭[2]、乳酸中毒[3]或新型冠狀病毒肺炎重癥患者[4]。人體發生惡性瘧原蟲感染后，白細胞中出現綠色包涵體和瘧色素的病例尚未見報道。本研究旨在回顧分析1例外周血白細胞綠色包涵體合并瘧色素病例的實驗室檢查結果和相應臨床癥狀，以加深廣大醫務工作者對該類病例的認識。

1 材料和方法

1.1 病例基本情況

患者，男，53歲。因高熱伴關節酸痛于當地醫院就診，熱峰39.2 ℃。當地醫院先后以靜滴頭孢吡肟+口服奧司他韋治療，未見明顯好轉，遂至上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院就診。患者服用退熱藥物后體溫可降至正常，但次日均出現反復。住院期間患者出現意識不清、呼吸急促、大小便失禁等癥狀。追問病史得知，患者2019年10月26—30日至尼日利亞出差，是否有蚊蟲叮咬史不詳。既往史：高血壓10年，血壓控制良好；1988年患甲型肝炎；2009年髕骨骨折，行手術；2010年股骨骨折，行手術；否認結核等其他傳染病史。查體：精神一般，體溫>37.0 ℃，脈搏139次/min，皮膚鞏膜黃染。經實驗室檢查提示惡性瘧原蟲感染，收治于重癥監護病房，予以青蒿琥酯抗瘧疾，輔以其他相應治療。治療期間患者病情曾現好轉，意識恢復，但某日突然加重，體溫再次升高，外周血CD3、CD4、CD8絕對計數顯著下降，提示免疫功能嚴重受損。后因多臟器衰竭、感染性休克、重癥肺炎、重癥免疫缺陷、混合型酸堿失調、電解質紊亂等并發癥，雖經全力救治，仍不幸離世。

1.2 研究方法

（1）樣本采集。采集患者入院時乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈全血2 mL、肝素抗凝全血4 mL，立即送檢；治療期間每日采集乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈全血2 mL，立即送檢。（2）血常規和C反應蛋白檢測。檢測前執行每日質控，質控通過后，采用全血細胞計數+C反應蛋白模式檢測，記錄結果。（3）生化項目檢測。檢測前執行每日質控，將肝素抗凝全血樣本以1 676×g離心5 min，取上清，進行檢測，記錄結果。（4）免疫膠體金瘧原蟲抗原檢測。將5 μL乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈全血置于膠體金板條小孔中，滴加裂解液2滴，靜置15 min后觀察結果。（5）瘧原蟲厚、薄血膜制作。厚血膜：取外周血2滴黏附于載玻片上，涂成直徑約1 cm的厚薄均勻的血膜，室溫干燥；薄血膜：取外周血l滴黏附于載玻片上，推制成薄片，干燥后以甲醇固定薄血膜。取吉姆薩染色液A液與B液，以1∶9的比例配置染液，混勻后染色30 min，流水沖凈染液，干燥后鏡檢。（6）油紅O染色。油紅O儲備液與蒸餾水以3∶2比例配置為油紅O染色液，靜置15 min。吸取油紅O染色液上層染色10 min，流水沖洗30 s，蘇木精染液染色2 min，流水沖洗5 min，干燥后鏡檢。

1.3 儀器和試劑

BC5390 CRP血液分析儀及配套試劑（深圳邁瑞公司）；AU5800全自動生化分析儀和總膽紅素、直接膽紅素、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、白蛋白、尿素、肌酐檢測試劑盒（美國貝克曼庫爾特公司）；免疫膠體金瘧原蟲抗原檢測（上海市臨床檢驗中心）；吉姆薩染液、油紅O染液（珠海貝索生物技術有限公司）。

2 結果

2.1 實驗室檢查結果

患者于上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院入院時血常規和生化檢查結果顯示，血小板計數為12×109/L（嚴重減少），中性粒細胞百分比為82.7%（升高），C反應蛋白>200 mg/L（升高），總膽紅素71.3 μmol/L（明顯升高）、直接膽紅素24.8 μmol/L（升高），肝、腎功能異常，見表1。免疫膠體金抗原檢測提示惡性瘧感染。

表1 患者實驗室檢查結果

2.2 外周血涂片鏡檢結果

患者入院時外周血涂片可見瘧原蟲環狀體[圖1（a）、圖1（b）]，蟲體密度高。治療期間瘧原蟲蟲體密度逐漸下降，但至治療后期仍未完全消失，外周血、腦脊液涂片均可見蟲體殘留（圖2）。患者病情惡化后外周血涂片中性粒細胞出現中毒顆粒，在約16%的中性粒細胞和少數單核中觀察到綠色包涵體和瘧色素[圖1（c）、圖1（d）]。胞質中包涵體呈藍綠色，數量不一、大小不等、形態不規則，具有一定折射性。油紅O染色后包涵體呈橘紅色，瘧色素未染色，提示包涵體油紅O染色陽性、瘧色素陰性（圖3）。

圖1 患者入院時外周血涂片鏡檢結果（×1 000）

圖2 患者治療后期外周血和腦脊液涂片（×1 000）

圖3 患者外周血涂片油紅O染色結果

3 討論

綠色包涵體是2009年Harris等在肝病患者外周血中性粒細胞和單核細胞中發現的類脂褐素物質[5]。目前為數不多的報道顯示其僅在急性肝衰竭、乳酸酸中毒、產氣莢膜梭菌或大腸埃希菌相關敗血癥、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒感染患者中被發現[6]。綠色包涵體的出現與疾病的不良預后密切相關。據統計，有56%～72%的出現綠色包涵體的肝病患者在氨基轉移酶急劇升高后病情迅速惡化，并在短時間內死亡，這個過程僅2～14 d[7-8]。本例患者因在非洲感染惡性瘧原蟲起病，回國后輾轉多時未明確病因，引起原蟲大量繁殖，轉至上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院時已進展為極為兇險的腦型瘧疾，外周血涂片可見大量惡性瘧原蟲環狀體。治療期間患者情況曾有好轉，臨床表現向好，意識逐漸恢復。但對外周血涂片的連續監測發現，不同階段的蟲體仍有殘留，甚至在治療后期，患者的腦脊液中依然存在蟲體，患者在病情急轉直下前免疫功能嚴重受損。因此，我們推測，持續的原蟲血癥導致免疫功能嚴重受損可能是患者后期病情突然加重的原因之一。

患者病情加重后，外周血涂片可見中性粒細胞和單核細胞中出現藍綠色包涵體和瘧色素。據統計，出現包涵體的細胞約占所有中性粒細胞的1%～10%[8]，并伴隨胞質空泡、顆粒增多以及杜勒小體等中性粒細胞中毒改變，這與我們觀察到的情況類似。HARRIS等[5]認為，綠色包涵體本質上可能與膽綠素相關，但是目前沒有針對膽綠素的染色方法來證實這一點。分析包涵體的結構后，發現中性粒細胞和單核細胞綠色包涵體的光學顯微鏡鏡下外觀、富脂性和耐酸性與蠟樣脂褐素一致，電子顯微鏡鏡下外觀與神經元脂褐素的報告相似[9]。脂褐素主要由被溶酶體消化的含脂殘留物組成，其中還包括蛋白質、碳水化合物和微量元素[10-11]。當肝臟因缺氧受損時，脂褐素從壞死的肝實質細胞中被釋放出來[12]，所以綠色包涵體可能是一種脂褐素樣物質，或類似的溶酶體降解產物，在肝臟和其他器官因缺血受損后被細胞吞噬。由于這類物質具有親脂性，因此使用油紅O染色結果應為陽性[8]。通過油紅O染色，我們發現包涵體確為陽性，而黃褐色結晶狀物質染色陰性。結合患者疾病背景及結晶狀物質形態，提示該物質為中性粒細胞吞噬的瘧色素。瘧色素是瘧原蟲分解代謝血紅蛋白的最終產物，隨著蟲體在紅細胞中裂體的增殖，瘧色素逐漸融合，最后隨破裂紅細胞進入血液，并被中性粒細胞和單核細胞吞噬。外周血吞噬細胞中能否觀察到瘧色素與瘧疾的嚴重程度相關，而大量含瘧色素中性粒細胞的出現同樣提示預后不良[13]。目前，臨床對于這類異常的報道相對較少，主要原因可能有以下3點：（1）發生率低，易漏檢；（2）忽視了該包涵體的折光性，容易誤認為是杜勒小體；（3）缺乏認識，發現但未報告。

外周血涂片中形態學異常對疾病的臨床判斷及預后至關重要。我們對這例腦型瘧疾患者在診療過程中出現在外周血白細胞中的形態學變化進行跟蹤觀察，發現綠色包涵體和瘧色素的出現對重癥瘧疾預后不佳患者病情的發展具有重要提示作用。希望通過對該病例的報道和分析，加深廣大實驗室工作人員和臨床醫務人員對這一現象的認識，避免漏檢的發生，以及時進行救治，盡量避免患者死亡。