CLIC4、SNHG3表達與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預后的關系

薛 艷， 王佳佳， 王馥香， 任秋偉

（1.南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院產科，河南 南陽 473000；2.南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院病理科，河南 南陽 473000；3.南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院檢驗科，河南 南陽 473000）

卵巢癌是臨床較為常見的嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一。由于Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌不易被察覺，多數患者被確診時已處于晚期，導致患者5年生存率較低。為提高Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌的診斷效率，尋找靈敏、便捷、創傷性小的生物學指標已成為臨床研究熱點[1]。有研究結果顯示，細胞內氯通道蛋白4（chloride intracellular channel protein 4，CLIC4）高表達與多種癌癥惡性狀態及預后顯著相關[2]。有研究發現，30例卵巢癌患者中有28例CLIC4和卵巢癌特異性蛋白α-平滑肌肌動蛋白呈高表達[3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在表觀遺傳、基因轉錄調控方面顯著影響腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲和轉移等。小核仁RNA宿主基因3（small nucleolar RNA host gene 3，SNHG3）是近期發現的與肝癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤惡性狀態及預后不良有關的因子[4-5]，但尚缺少關于SNHG3對Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的診斷及預后預測作用的研究。為此，本研究擬通過探討Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌組織中CLIC4、SNHG3的表達與臨床特征因素之間的關系及其對患者預后的影響，為臨床提高Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的診斷效率提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2012年10月—2015年10月南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院行全面分期手術治療的Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者113例（卵巢癌組），年齡（49.83±9.94）歲。納入標準：（1）經冰凍及石蠟病理學切片確診為卵巢癌，采用2013年國際婦產科聯盟（the International Federation of Obstetrics and Gynecology，FIGO）分期標準[6]進行病理分期，所有患者分期均處于Ⅰ～Ⅱ期；（2）均為初次診斷，且肝、腎功能均正常；（3）病灶組織僅位于卵巢一側或雙側，術前、術中檢查無腹水或僅有少量腹水；（4）入組前未行放化療以及盆腔器官手術治療。另選取同期南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院經B超或其他影像學檢查及病理組織切片確診為良性卵巢囊腫的患者76例（對照組），年齡（48.79±9.06）歲。排除標準：（1）有婦科炎癥患者；（2）伴有其他腫瘤者；（3）伴有高血壓、糖尿病以及心血管等慢性疾病者。本研究經南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院倫理委員會批準，所有研究對象或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 手術治療方法 在術中探查腹腔，確定腫瘤位置、性質及包膜的完整情況，同時根據患者有無生育要求等采取不同的手術方式。對于腫瘤最大直徑<10 cm的患者行腹腔鏡全面分期手術，對于腫瘤最大直徑≥10 cm且粘連嚴重的患者采用開腹全面分期手術。根據術式不同，113例卵巢癌患者中有78例行腹腔鏡全面分期手術，35例行開腹全面分期手術。對照組均采用手術治療。

1.2.2 資料收集 收集所有研究對象的基線資料，包括：（1）年齡、體質量指數（body mass index，BMI）、經產次數、絕經狀況以及月經紊亂情況；（2）卵巢癌患者腫瘤分期、病理類型、腫瘤直徑、組織病理學分級以及是否出現轉移等；（3）所有研究對象相關指標[糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）]、人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）、CLIC4及SNHG3等]的檢測結果，根據CA125、HE4的檢測結果及研究對象的絕經情況計算卵巢惡性腫瘤風險（the risk of ovarian malignancy algorithm，ROMA）指數，用于評估卵巢癌的發生風險，計算公式[7]為：絕經前預測指數（predictive index，PI）=-12.0+2.38×ln（HE4）+0.0626×ln（CA125）；絕經后PI=-8.09+1.04×ln（HE4）+0.732×ln（CA125），式中ln為自然對數；ROMA指數=exp（PI）/[1+exp（PI）] ×100。ROMA指數評價標準：檢測特異性為75%時，絕經前ROMA指數>11.4%、絕經后ROMA指數>29.9%提示卵巢癌高風險。

1.2.3 HE4、CA125的檢測 收集所有研究對象術前晨起空腹肘靜脈血5 mL，置于無抗凝劑的Eppendorf管中，靜置10 min后500×g低溫離心15 min，分離血清，置-40 ℃冰箱中保存。采用酶聯免疫吸附試驗檢測HE4，試劑購自美國R&D公司。采用cobas e601電化學發光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學發光法）檢測CA125。

1.2.4 組織樣本中CLIC4表達的檢測 術中獲得的病理組織樣本部分用于免疫組化檢測，部分用于實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測。組織樣本經石蠟包埋切片后，采用免疫組化SP試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）進行檢測。主要步驟：將石蠟組織切片、脫蠟、水化，經乙醇梯度洗脫后，采用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）沖洗，將切片組織置于檸檬酸抗原修復液中洗滌，沖洗后加入內源性過氧化物酶，經血清封閉，滴加一抗（兔抗人單克隆CLIC4抗體，稀釋濃度為1∶100，美國Santa Cruz公司），加入二抗（山羊抗兔IgG抗體），PBS清洗后，加入二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，然后復染、分化、脫水、透明，中性樹膠封片。細胞質或細胞核出現棕黃色顆粒為CLIC4陽性。根據細胞染色強度及陽性細胞所占比例進行半定量分析：陽性細胞所占比例<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；根據細胞著色深淺進行評分，未染色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；綜合2項評分，0～1分判定為陰性（-）、1～4分為弱陽性（+）、5～8分為陽性（++）、9～12分為強陽性（+++）；將陰性和弱陽性定義為低表達，陽性和強陽性定義為高表達。計算CLIC4陽性細胞染色率：在CX31型電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下觀察每個切面內2 000個以上的細胞，計算陽性細胞染色百分率，采用Image Pro Plus病理圖像分析軟件（美國MEDIA CYBERNETICS圖像技術公司）對免疫組化染色切片進行分析，計算染色陽性細胞數。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測SNHG3的表達 采用PrimeScript RT Ⅱ逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司）提取組織樣本中的總RNA，并逆轉錄成互補DNA（complementary DNA，cDNA）。檢測儀器為SimpliAmp PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司）。PCR反應體系：總體積為20 μL，SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.8 μL、cDNA 2 μL，雙蒸水0.6 μL，Rox-Dye 0.4 μL。引物序列：SNHG3上游引物為5'-GTCAGCTACATCTTCATTCACTAC-3'、下游引物為5'-AGTGTCAGTTTAAGGTTACGC-3'；內參基因β-actin上游引物為5'-TGCAAACCTGTCCGGCAGCTGTTA-3'、下游引物為5'-GCCCTAAAGTCGTGACCAGC-3'。PCR擴增條件：95 ℃預變性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；40個循環。對每個循環后的SYBR Green進行熒光信號檢查，采用熔解曲線監測擴增產物純度。重復檢測3次，每次設置3個復孔。ΔΔCt=ΔCt卵巢癌組-ΔCt對照組，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因。擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳。將卵巢癌組織中SNHG3相對表達量的中位數作為臨界值，分為高表達組和低表達組。

1.2.6 隨訪 采用電話、門診復診等方式對113例卵巢癌患者進行隨訪。收集患者預后生存及生活質量情況。隨訪截止時間為2019年4月30日，隨訪中位時間為39個月，隨訪至患者死亡或到隨訪截止時間為止。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件及Excel 2010軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用兩獨立樣本t檢驗或非配對t檢驗。呈非正態分布的計量資料以中位數（M）（范圍）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier生存曲線分析CLIC4、SNHG3對卵巢癌預后的影響，比較采用Log-rank檢驗。采用Cox比例回歸分析評估Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌預后的影響因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌組與對照組一般資料的比較

卵巢癌組CA125、HE4、ROMA指數與對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.001），年齡、BMI和經產次數2個組之間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 卵巢癌組與對照組一般臨床資料比較

2.2 卵巢癌組與對照組組織中CLIC4表達的比較

免疫組化結果顯示，卵巢癌組CLIC4陽性的高表達率及CLIC4免疫組化積分百分率顯著高于對照組（P<0.001）。見圖1、表2。

表2 卵巢癌組和對照組CLIC4表達情況比較

圖1 卵巢癌組與對照組免疫組化檢測結果

2.3 卵巢癌組與對照組組織樣本中SNHG3相對表達量的比較

卵巢癌組SNHG3的相對表達量為0.726±0.097，顯著高于對照組（0.325±0.062）（P<0.001）。見圖2。

圖2 卵巢癌組與對照組組織樣本中SNHG3相對表達量的比較

2.4 CLIC4、SNHG3表達與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者臨床病理特征之間的關系

CLIC4高表達與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者的病理類型（漿液性癌）、組織學分級（G2～G3級）、臨床分期（Ⅱ期）有關（P<0.05）。進一步分析不同病理類型患者之間CLIC4表達的差異，結果顯示，漿液性癌患者、黏液性癌患者與子宮內膜樣癌患者CLIC4表達差異有統計學意義（χ2值分別為16.878、15.990，P=0.000），其他病理類型之間差異均無統計學意義（P>0.05）。根據SNHG3相對表達量的中位數（0.657）將卵巢癌患者分為高表達（SNHG3>0.657）和低表達（SNHG3≤0.657），結果顯示SNHG3高表達與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者的組織學分級、臨床分期有關（P<0.05）。見表3。

表3 CLIC4、SNHG3表達與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者臨床病理特征之間的關系

2.5 CLIC4、SNHG3表達與患者預后的關系

隨訪結果顯示，113例Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者5年內有30例（26.55%）復發、13例（11.50%）死亡。CLIC4高表達組總體生存率（overall survival rate，OS）、疾病無進展生存率（disease progression-free survival rate，PFS）均低于CLIC4低表達組（Log-rankχ2值分別為5.108、6.541，P<0.05）。SNHG3高表達組OS、PFS均低于SNHG3低表達組（Log-rankχ2值分別為5.467、6.626，P<0.05）。見圖3。

圖3 CLIC4、SNHG3對Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預后影響的Kaplan-Meier曲線

2.6 Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌預后影響因素的分析

Cox比例回歸分析結果顯示，CA125、HE4、CLIC4、SNHG3、組織學分級、臨床分期均是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預后（生存）的影響因素。見表4。

表4 Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預后（生存）的影響因素

3 討論

有研究結果顯示，Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者5年生存率明顯高于晚期卵巢癌患者[7]。因此，對于Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的研究熱點多集中于尋找靈敏、便捷、創傷性小的生物學指標，以提高Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的診斷效率。目前，研究較多的生物學指標有CA125、HE4、巨噬細胞遷移抑制因子等，其中CA125是輔助診斷卵巢癌最常用的指標，但CA125存在一定比例的假陽性，且敏感性較低，因此其作為早期卵巢癌的診斷標志物存在一定的局限性[8-11]。CLIC4是細胞內的一種氯通道，主要調節細胞內pH值和細胞體積的變化。CLIC4在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌中呈高表達，而在正常組織中幾乎不表達；CLIC4的表達強度與腫瘤細胞分化程度、淋巴結轉移等呈正相關[12]。SINGHA等[13]的研究結果顯示，CLIC4對早期或低分級卵巢癌的診斷具有更高的價值，診斷效能明顯優于CA125。CLIC4高表達可促進卵巢癌組織中的纖維母細胞向肌纖維母細胞轉化[14]。目前，國內關于CLIC4與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者臨床病理特征之間的關系以及CLIC4在卵巢癌預后評估中的作用的研究較少。為此，本研究探討了CLIC4在Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌中的價值。結果顯示，Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者組織中CLIC4的表達量顯著高于良性卵巢囊腫患者（P<0.001）。隨訪結果也顯示，CLIC4是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預后的影響因素（RR=2.797，95%可信區間為1.308～7.224）。

腫瘤組織中存在異常表達的lncRNA，在腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡過程發揮作用，提示部分lncRNA或可作為腫瘤診斷的潛在的生物標志物[15]。SNHG3是大腸埃希菌U17菌株的宿主基因，位于1號染色體短臂3區6號帶。有研究結果顯示，SNHG3與肝癌、神經膠質細胞瘤等惡性腫瘤的預后顯著相關[16-17]。有研究結果顯示，卵巢癌組織中SNHG3呈高表達，較高的SNHG3表達量預示著卵巢癌患者預后不良[18]。本研究結果顯示，Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者組織中SNHG3的相對表達量顯著高于良性卵巢囊腫患者（P<0.001），且SNHG3表達與卵巢癌的臨床分期、組織學分級等有關，提示SNHG3對Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌病情的判斷有一定價值。

本研究結果顯示，漿液性卵巢癌患者組織樣本中CLIC4表達陽性率明顯高于其他病理類型（P=0.000），但預后分析并未發現病理類型是卵巢癌患者預后的影響因素，這可能與漿液性卵巢癌是卵巢癌中最為常見的病理類型有關。本研究結果還顯示，組織學分級G2～G3級、臨床分期Ⅱ期的卵巢癌患者組織中CLIC4、SNHG3表達均分別高于G1級、臨床分期Ⅰ期（P<0.05），且組織學分級及臨床分期是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預后的影響因素（RR分別為2.886、2.032，95%可信區間分別為1.373～8.005、1.199～7.522）。

本研究尚存在一定的不足之處：（1）未將CLIC4、SNHG3與HE4、CA125等傳統指標進行比較，后續研究將進一步探討CLIC4、SNHG3及HE4、CA125等傳統指標與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌臨床病理特征及預后的關系；（2）本研究獲的樣本主要為卵巢癌組織，因此不利于臨床診斷，后續將探討在一些更易獲取的樣本，如外周血樣本中，CLIC4、SNHG3是否具有與組織樣本一樣的臨床價值，以提高診斷的便捷性與靈敏度。

綜上所述，CLIC4、SNHG3高表達與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的臨床病理特征、預后均顯著相關。CLIC4、SNHG3是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預后（生存）的影響因素。