不同保存條件及反復凍融對血清HCV抗體檢測的影響

江雅平， 李智慧， 李志艷， 王玎玲

（北京大學第一醫院檢驗科，北京 100034）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）抗體的準確測定是診斷丙型肝炎的關鍵，全面質量管理是獲得準確測定結果的重要保證。樣本分析全過程的不當處理均會影響檢驗結果的準確性[1]。分析前產生的誤差占整體誤差的60%以上[2]。分析前影響因素包括樣本的采集、前處理、儲存等[3]。樣本儲存時，血細胞的各種代謝活動均會直接影響樣本的質量[4]。采集的血清樣本應及時檢測，但在實際工作中，待測樣本常在常溫或4 ℃條件下運送至實驗室；由于基層醫療機構血樣本不是集中采集，血清常置于低溫保存一定時間后檢測；科研所用樣本通常凍存于-80 ℃后進行批量檢測，因此不可避免地會在反復凍融后檢測。我們在實際工作中發現，留取的HCV抗體陽性（S/CO值≥1）血清樣本凍存后再次檢測，HCV抗體水平較之前會大幅下降。查閱文獻，未能找到不同儲存條件和反復凍融對血清HCV抗體檢測結果影響的相關研究。為此，本研究在進行嚴格質量控制的前提下，分析HCV抗體的最優儲存條件，為分析前的質量控制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

采用分離膠真空采血管采集北京大學第一醫院門診及住院患者的靜脈血，2 290×g離心10 min，分離血清，肉眼觀察均無脂血、黃疸和溶血。將當天采集、當天檢測的50份血清樣本用于探討不同保存溫度、保存時長對血清樣本HCV抗體測定結果的影響。將HCV抗體基線S/CO值<1的15例樣本、S/CO值為1～<2的17例樣本、S/CO值為2～<5的14例樣本、S/CO值≥5的15例樣本用于分析反復凍融對HCV抗體檢測的影響。

1.2 方法

1.2.1 HCV抗體檢測 所有樣本均采用ARCHITECT i2000SR全自動免疫分析系統（美國雅培公司）及配套試劑由同一名工作人員完成檢測。HCV抗體質控檢測當天均在控，保證檢測數據穩定、可靠。以S/CO值≥1判定為HCV抗體陽性。

1.2.2 不同保存溫度對HCV抗體的影響 將收集的50份血清樣本中的每份均分為4份，分裝于2.0 mL螺口凍存管（美國Nunc公司）中，及時蓋蓋，防止血清樣本蒸發。分裝后立即將4份樣本分別置于常溫、4 ℃、-20 ℃及-80 ℃條件保存，分別在保存后1、3、5、7 d再次取出檢測HCV抗體水平。將50份血清樣本當天檢測的HCV抗體結果作為基線水平。

1.2.3 反復凍融對HCV抗體的影響 將收集的61份血清樣本中的每份樣本均分為2份，分裝于2.0 mL螺口凍存管（美國Nunc公司）中，分別置于-20 ℃和-80 ℃凍存，2 h后解凍，并檢測HCV抗體，測定完成后立即凍存2 h，反復凍融4次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。呈非正態分布的計量數據以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，多組間比較采用相關變量非參數Friedman檢驗，兩兩比較采用配對樣本Wilcoxon檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 50份血清樣本不同溫度不同保存時間HCV抗體水平

以當天檢測的50份血清樣本HCV抗體結果作為基線水平，S/CO值為0.59～6.12，M（P25～P75）為0.86（0.78～0.94），其中有9份血清樣本HCV抗體陽性（S/CO值為1～<2的6份，≥2的3份。與基線水平比較，常溫和4 ℃保存1、3、5、7 d的HCV抗體水平差異均無統計學意義（P>0.05）；-20 ℃和-80 ℃保存1 d的HCV抗體水平顯著降低（P<0.05），且保存時間越長，HCV抗體水平下降幅度越大。在保存天數相同的情況下，-20 ℃和-80 ℃保存的HCV抗體結果低于常溫和4 ℃保存（P<0.001）。見表1。

表1 不同溫度不同保存時間血清HCV抗體水平（S/CO）值比較 M（P25～P75）

2.2 不同保存溫度和保存時間50份血清樣本HCV抗體陽性情況

50份血清樣本中，有9份（18%）HCV抗體陽性，其中S/CO值為1～<2的6份，≥2的3份。常溫和4 ℃保存1、3、5、7 d的HCV抗體陽性率無變化。-20 ℃和-80 ℃保存1 d，6份S/CO值為1～<2的陽性樣本中分別有3份和4份轉為陰性；保存3 d，6份S/CO值為1～<2的陽性樣本均轉為陰性；S/CO值≥2的3份陽性樣本-20 ℃和-80 ℃保存1、3、5、7 d結果無變化。見表2。

表2 不同保存溫度、不同保存時間血清樣本HCV抗體陽性的變化

2.3 反復凍融對HCV抗體檢測的影響

與基線水平比較，61份血清樣本的HCV抗體檢測結果隨凍融次數的增加而逐漸降低（P<0.001）。在凍融次數相同的情況下，-20 ℃與-80 ℃保存的樣本HCV抗體檢測結果之間差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 反復凍融后血清樣本HCV抗體檢測結果（S/CO）值的變化 M（P25～P75）

2.4 不同凍融次數對HCV抗體陽性率的影響

61份血清樣本-20 ℃和-80 ℃凍融2次后分別有8份、9份樣本的HCV抗體結果由陽性轉變為陰性；凍融3次分別有9份、10份轉變為陰性；凍融4次分別有11份、11份轉變為陰性。

2.5 不同S/CO值樣本反復凍融后HCV抗體S/CO值的變化

對于基線S/CO值<1的血清樣本，-20 ℃和-80 ℃凍融1次，S/CO值下降均>40%；凍融3次，S/CO值下降均>50%。對于基線S/CO值為1～<2的血清樣本，-20 ℃和-80 ℃凍融1～4次，S/CO值分別下降36.84%～46.05%和36.91%～46.10%。對于基線S/CO值為2～<5的血清樣本，-20 ℃和-80 ℃凍融1～4次，S/CO值分別下降30.92%～49.80%和30.90%～49.78%。對于基線S/CO值≥5的血清樣本，-20 ℃和-80 ℃凍融1次，S/CO值分別下降9.99%和8.94%；凍融4次，S/CO值下降均<20%。見表4。

表4 不同溫度反復凍融后HCV抗體S/CO值的下降百分比 %

3 討論

HCV抗體是HCV感染篩查的主要指標。HCV感染可導致肝臟發生慢性炎癥和纖維化，部分患者可發展為肝硬化甚至肝癌。由于部分基層醫療機構每天的樣本量有限，難以做到即刻檢驗，需將樣本低溫保存后統一檢測；還有一些實驗室出于日后復查或科研的考慮，對一些已完成檢測的樣本進行低溫保存，因此有些檢測結果可能會受保存條件或反復凍融的影響[5]。

關于血清樣本反復凍融對各項檢測指標的影響，國內外已有報道。GUNASEKARA等[6]的研究結果顯示，血清總膽固醇和三酰甘油反復凍融10次以上，檢測值與初始值相比無顯著變化（P>0.05）。CUHADAR等[7]的研究結果顯示，反復凍融1～10次對血清尿素氮、尿酸、總蛋白、白蛋白、乳酸脫氫酶等有顯著影響，對天門冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶和γ-谷氨酰基轉移酶等指標無顯著影響。余國慶[8]等的研究結果顯示，血清胃蛋白酶原Ⅰ水平在-20 ℃凍融2次后顯著降低，胃蛋白酶原Ⅱ水平在凍融3次后顯著下降。HILLEBRAND等[9]的研究結果顯示，血漿腎素活性在-20 ℃凍融2次后升高，促腎上腺皮質激素水平在凍融3次后顯著降低，而總三碘甲狀腺原氨酸（total triiodothyronine，TT3）、總甲狀腺素（total thyroxine，TT4）、反三碘甲狀腺原氨酸（reverse triiodothyronine，rT3）、游離甲狀腺素（free thyroxine，FT4）、促甲狀腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）、甲狀腺球蛋白、胰高血糖素水平在凍融3次后無明顯變化。然而，司學眾等[10]的研究結果顯示，與基線水平比較，血清樣本-25 ℃凍融1次，除TSH外，TT3、TT4、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）和FT4水平差異均有統計學意義（P<0.05）；凍融 2次后，TT3、TT4、FT3、FT4和TSH水平差異均有統計學意義（P<0.05）。導致研究結果不一致的原因可能與凍存溫度、檢測系統[HILLEBRAND等使用的是AutoDelfia時間分辨熒光免疫分析儀（芬蘭珀金埃爾默公司），司學眾等使用的是ARCHITECT i2000SR全自動免疫分析系統]、檢測方法等不同有關。國內已有關于不同儲存條件和時間對HCV RNA檢測結果影響的報道[11]，但尚未見對HCV抗體檢測影響的報道。為此，本研究探討了保存條件和反復凍融對HCV抗體檢測結果的影響。

本研究設常溫、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃ 4種儲存溫度，在相同時間點檢測，消除了放置時間對檢測結果的影響，結果顯示，血清樣本在常溫或4 ℃保存7 d，HCV抗體的S/CO值未發生顯著變化（P>0.05）；但-20 ℃和-80 ℃保存1 d，HCV抗體水平即顯著下降（P<0.001），凍存時間越長，HCV抗體水平下降幅度越大。反復凍融實驗結果顯示，基線S/CO值越低的樣本反復凍融后S/CO值的下降百分比越大。對于基線S/CO值<1的血清樣本，不論是-20 ℃，還是-80 ℃保存，凍融1次后HCV抗體檢測結果即顯著下降，下降幅度>40%；凍融3次后HCV抗體檢測結果下降>50%。對于基線S/CO值為1～<2的血清樣本，-20 ℃和-80 ℃凍融1～4次，S/CO值分別下降36.84%～46.05%和36.91%～46.10%。凍融次數越多，HCV抗體檢測結果下降幅度越大。因此，對于S/CO值為1～<2的血清樣本，冷凍保存后極易使HCV抗體由陽性轉變為陰性，導致漏診。這可能是由于反復凍融導致血清樣本中生物分子降解、活性發生改變或產生不溶性沉淀物，進而導致血清HCV抗體檢測結果下降。

綜上所述，HCV抗體檢測應盡量在采血當天完成，如果無法當天完成，短期宜4 ℃保存，不宜冷凍保存，也不宜凍融。如果需要復測，應在4 ℃保存7 d內完成復測。冷凍保存會對HCV抗體檢測產生較大影響，使HCV的檢出率下降，進而影響對患者病情的判斷。