同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法檢測血清睪酮候選參考方法的建立及應用

孫賀偉， 居 漪， 朱嶺峰， 李 卿， 金中凎， 張素潔

（上海市臨床檢驗中心，上海 200126 ）

睪酮是一種類固醇類激素，由膽固醇經一系列酶促反應生成。準確的睪酮檢測結果有助于男性性腺功能減退、腫瘤[1-2]和女性多囊卵巢綜合征[3]等疾病的診斷。目前，血清睪酮檢測多采用免疫學方法。臨床常規方法在檢測正常男性血清睪酮水平時具有較好的準確性，但在檢測女性或兒童血清睪酮水平時并不準確[4]。因此，要想實現血清睪酮檢測的標準化就必須建立參考方法。目前，德國臨床化學和檢驗醫學學會[5]、比利時根特大學[6]已建立了基于氣相色譜質譜的參考方法；美國國家標準和技術研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）[7]和美國疾病預防控制中心（the Centers for Disease Control and Prevention，CDC）[8]建立了基于液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LCMS/MS）的參考方法。在此基礎上，本研究擬建立一種基于同位素稀釋液相色譜-串聯質譜（isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry，ID-LC-MS/MS）的精密度、準確度均良好，操作簡便的候選參考方法，并對該方法的檢測性能進行評價，同時采用該方法對臨床常規檢測方法（微粒子化學發光法）進行評價。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

LC-MS/MS檢測系統由5500 QTRP串聯質譜儀（美國SCIEX公司）和Agilent1290UPLC液相色譜系統（美國Agilent公司）組成。Vortex-2渦旋混合器（美國Scientific Industries公司），5424R冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司），TS-18824氮吹儀（美國ThermoFisher Scientific公司），Access 2全自動微粒子化學發光免疫分析儀（美國Beckman Coulter公司）及配套睪酮檢測試劑（微粒子化學發光法）。睪酮標準品（純度99%）購自德國Dr. Ehrenstorfer公司；睪酮同位素內標（睪酮-2，3，4-13C3）購自美國Cerilliant公司[（100.0±0.5）μg/mL]；甲酸（質譜純）、正已烷（質譜純）、乙酸乙酯（質譜純）、乙腈（質譜純）均購自美國ThermoFisher Scientific公司。實驗用水由本實驗室采用Millipore純水系統自制（18.2 MΩ）。

1.2 方法

1.2.1 色譜分析條件 分析柱為Kinetex XB C18 100A柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Phenomenex公司）；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫（0～0.50 min 10%B；0.51～3.00 min 10%～100%B；3.01～4.50 min 100%B；4.51～6.00 min 10%B），流速為0.3 mL/min，進樣體積為10 μL。

1.2.2 質譜分析條件 電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）離子源，正離子模式。噴霧氣為65，輔助加熱氣為65，氣簾氣為30，碰撞氣為中等，離子源電壓為5 500 V，離子源溫度為400 ℃。多反應監測掃描分析睪酮的離子通道選擇分別為289.2/97.1 amu、289.2/109.1 amu，睪酮同位素內標為292.2/100.1 amu、292.2/112.1 amu。

1.2.3 樣本處理 吸取100～300 μL血清，加入內標工作液（10 ng/mL），使得睪酮與內標的質量比為1∶1，室溫平衡1 h，再加入1 mL正已烷-乙酸乙酯（V∶V=1∶1）溶液，渦旋振蕩10 min，然后14 087×g離心5 min，取上清液，30 ℃吹干，加入200 μL 50%乙腈重組，渦旋混勻2 min后，吸取100 μL轉移至進樣瓶，上機分析。

1.2.4 儲備液及工作液配制 睪酮和同位素內標均用甲醇配成1 mg/mL的儲備液，然后用50%甲醇將睪酮儲備液稀釋至10 ng/mL，作為標準曲線工作液，4 ℃保存。將同位素內標儲備液稀釋至50 ng/mL，作為內標工作液，4 ℃保存。分別吸取250、400、500、600、750 μL標準曲線工作液（10 ng/mL），與100 μL內標工作液（50 ng/mL）混勻，使標準曲線中睪酮與內標質量比分別為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5。

1.3 方法學評價

參考美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）C62-A文件[9]和EP15-A3文件[10]，對本方法的方法殘留、特異性、線性范圍、精密度、準確度進行驗證。

1.3.1 特異性 分析內標化合物對分析物的干擾。進樣時，在標準曲線后添加1個只含內標不含分析物的樣本（標記為QC0）。若每批次QC0樣本的分析物色譜峰信噪比（signal-to-noise ratio，RSN）均<3∶1，則認為內標對分析物無干擾。

1.3.2 方法殘留 取睪酮<0.01 ng/mL的低濃度血清，加入睪酮標準溶液，配制成睪酮濃度為20 ng/mL的高濃度樣本（H），將不含分析物的50%甲醇作為空白樣本（O）。經過樣本預處理后，按照H→O的順序重復進樣3次。若空白樣本O中分析物的RSN<3∶1，則認為該方法無殘留。

1.3.3 精密度 依據CLSI EP15-A3文件對精密度的要求，測定2017年參考實驗室外部質量評價計劃（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA）比對樣本，共測定3 d，每天分析1批。每個批次分析2個濃度RELA樣本，每批次每個濃度預處理3次，并重復測定5次，計算每個濃度的批內變異系數（coefficient of variation，CV）和批間CV。

1.3.4 準確度 通過測定有證參考物質SRM971和參加RELA來評價本方法的準確度。每個樣本共測定3個批次，每批次每個濃度預處理3次，并重復測定3次。

1.3.5 線性范圍 收集睪酮<0.5 ng/mL的低濃度血清，添加睪酮儲備液，配制成血清睪酮濃度為22.00 ng/mL 的高濃度樣本（H），以睪酮濃度為0.034 ng/mL的混合血清樣本為低濃度樣本（L）。按照等體積對倍稀釋方法稀釋成11個濃度（0.034、1.14、2.78、4.15、5.53、8.27、11.02、13.76、16.51、19.25、22.00 ng/mL）。將稀釋后的樣本進行前處理后重復檢測2次，計算實測值與理論值之間的線性關系。若r≥0.995，且殘差<8.75%，則認為本方法在0.034～22.00 ng/mL范圍內線性良好。

1.3.6 最低定量限 用50%甲醇對已知濃度（4.45 ng/mL）的血清樣本進行稀釋，得到理論濃度分別為50、20、10 pg/mL的定量限樣本。將不同濃度定量限樣本各分成10份，預處理后檢測，得到實測值。將同時滿足偏移≤10%、CV≤7%、RSN≥10的實測值定義為定量限。

1.3.7 基質效應 將6份血清（3份女性樣本、3份男性樣本）分別與等體積50%甲醇混合，得到6份混合血清。將原始血清樣本和混合血清樣本按樣本預處理方法處理，按混合血清→候選基質（50%甲醇）的順序重復進樣3次，計算分析物/內標比值。若混合樣本的分析物/內標比值與理論比值的偏差≤±20%，則判定為無相對基質效應。

1.4 臨床常規檢測方法（微粒子化學發光法）正確度評價

參考CLSI EP9-A3文件[11]，使用建立的IDLC-MS/MS方法對微粒子化學發光法的正確性進行評價。收集臨床血清樣本122例，排除脂血、黃疸、脂濁等樣本，分別采用微粒子化學發光法和本方法檢測睪酮濃度。每份樣本每種方法均重復檢測3次，計算均值。以ID-LC-MS/MS結果為橫坐標，以微粒子化學發光法結果為縱坐標，進行偏差分析。

1.5 不確定度初步評定

依據文獻[12]對血清樣本檢測結果的不確定度的來源進行分析。其中，A類不確定度主要來自樣本的重復測定；B類不確定度主要來源于睪酮標準物質純度、睪酮標準物質稱量、睪酮標準物質溶解、移液器移液過程引入的不確定度。

1.6 統計學方法

采用MedCalc 18.2.1軟件、Excel 2013軟件進行統計分析。采用五點包括法計算血清睪酮濃度。采用Passing-Bablok線性回歸分析、Bland-Altman一致性分析對方法比對結果進行分析。

2 結果

2.1 方法建立及方法學評價

2.1.1 方法殘留和特異性 ID-LC-MS/MS檢測血清睪酮的分析時間為5 min，特異性好，無殘留。見圖1。

圖1 ID-LC-MS/MS的殘留和特異性

2.1.2 精密度 ID-LC-MS/MS的批內精密度≤2.3%，批間精密度≤2.2%。見表1。

表1 ID-LC-MS/MS檢測血清睪酮的精密度

2.1.3 準確度 在2017年的RELA比對中，本實驗室（編號為54）結果符合等效限要求（±8.75%）。本法測定有證參考物質SRM971的結果在規定的不確定度范圍（6.44±0.15）ng/mL]內。見表2。

表2 ID-LC-MS/MS檢測血清睪酮的準確度

2.1.4 線性范圍 在0.034～22.00 ng/mL范圍內，實測值和理論值的相關性良好（r=0.999）。見圖2。

圖2 ID-LC-MS/MS檢測血清睪酮的線性范圍

2.1.5 最低定量限 同時滿足偏移≤10%、CV≤7%、RSN≥10的最低定量限為20 pg/mL。見表3。

表3 ID-LC-MS/MS檢測血清睪酮的最低定量限

2.1.6 基質效應 6份混合樣本的分析物/內標比值與理論比值的偏差（相對基質效應）分別為5.6%、2.7%、6.9%、2.8%、-4.4%、-1.50%。見表4。

表4 ID-LC-MS/MS檢測血清睪酮的基質效應

2.2 臨床常規檢測方法（微粒子化學發光法）評價

當血清睪酮濃度為0.09～18.37 ng/mL時，微粒子化學發光法與ID-LC-MS/MS具有良好的相關性。2種方法的Passing-Bablok線性回歸方程為Y微粒子化學發光法=0.880 597XID-LC-MS/MS-0.109 403（截距的95%可信區間為0.016 23～0.202 00，斜率的95%可信區間為0.840 2～0.930 8，r=0.963），見圖3。2種方法檢測結果之間的平均偏差為-24.4%，見圖4。高濃度（睪酮>1 ng/mL）樣本2種方法檢測結果之間的平均偏差為6.3%，見圖5。低濃度（睪酮≤1 ng/mL）樣本2種方法檢測結果之間的平均偏差為62.4%，見圖6。

圖3 微粒子化學發光法與ID-LC-MS/MS檢測血清睪酮的相關性

圖4 微粒子化學發光法與ID-LC-MS/MS血清睪酮檢測結果的Bland-Altman圖

圖5 微粒子化學發光法與ID-LC-MS/MS檢測高濃度（睪酮>1 ng/mL）樣本的Bland-Altman圖

圖6 微粒子化學發光法與ID-LC-MS/MS檢測低濃度（睪酮≤1 ng/mL）樣本的Bland-Altman圖

2.3 不確定度評定

以2017 RELA-A樣本為例，對ID-LCM S/M S檢測血清睪酮的不確定度進行評定，結果見表5。根據表5中各相對標準不確定度分量計算出合成相對標準不確定度為0.012 852。2017 RELA-A樣本測定均值為4.32 ng/mL，擴展不確定度為0.11 ng/mL（包含因子k=2）。

表5 ID-LC-MS/MS檢測2017 RELA-A樣本的不確定度評定

3 討論

本研究參考美國CDC的參考測量程序，建立了基于LC-MS/MS技術的血清睪酮候選參考方法。相對于氣相色譜質譜參考方法的樣本前處理過程，美國NIST和美國CDC分別基于LCMS/MS技術建立的2種參考方法的前處理過程相對簡單，但操作步驟仍較多。美國NIST參考方法[7]的樣本前處理需先經過液相萃取，再復溶，用正己烷進行2次液液萃取。美國CDC參考方法[8]的樣本前處理需先調節樣本pH值，再用乙酸乙酯-正已烷（V∶V=3∶2）溶液萃取2次，氮氣吹干，然后用碳酸鹽溶液復溶，之后再用正已烷萃取2次。復雜的樣本前處理步驟有助于除去雜質對睪酮分析的干擾，提高質譜響應，但樣本前處理時間會大大增加。在滿足精密度和準確度要求的同時，本研究對樣本前處理過程進行優化，采用正己烷-乙酸乙酯一步萃取。另外，美國NIST和美國CDC參考方法的色譜分析時間均較長（美國CDC方法為16 min，美國NIST方法為40 min），而本研究建立的ID-LC-MS/MS法采用超高壓液相色譜串聯質譜系統和粒徑為1.7 μm的超高效液相色譜柱，色譜分析時間縮短至5 min。

采用LC-MS/MS技術實現準確測量的關鍵之一是排除與分析物結構相同或相似物質的干擾，BOTELHO等[8]證實18種與睪酮相對分子質量接近的化合物對美國CDC參考方法檢測睪酮無影響。張天嬌等[13]的研究結果顯示，與睪酮相對分子質量相同的表雄酮經過液相分離，可以排除對睪酮檢測的影響。本研究的不足之處在于未對睪酮結構類似物等物質進行干擾分析，但可以通過2點間接排除部分干擾物對IDLC-MS/MS法檢測睪酮的影響：（1）相對于氘標記的同位素內標，采用13C標記的同位素內標在液相色譜和質譜中的變化與睪酮高度一致，且物理性狀穩定，半衰期更長；（2）ID-LCMS/MS檢測122例臨床樣本血清睪酮的定量色譜峰和定性色譜峰面積比值與標準曲線中兩者的峰面積比值進行比較，無明顯差異。

本研究結果顯示，臨床常規檢測方法（微粒子化學發光法）與ID-LC-MS/MS法檢測結果的相關性較好（r=0.963），但結果偏差較大，平均偏差為-24.4%。本研究根據ID-LC-MS/MS檢測結果將臨床樣本分為高、低2個濃度，低濃度為血清睪酮≤1 ng/mL，高濃度為血清睪酮>1 ng/mL，然后再進行Bland-Altman一致性分析。結果顯示，低濃度樣本2種方法的平均偏差為-62.4%，高濃度樣本2種方法的平均偏差為6.3%，與文獻報道[14]一致。由此可見，微粒子化學發光法檢測低濃度睪酮的正確性并不理想。原因可能是抗體與其他類固醇激素會產生交叉反應，也可能與睪酮低濃度標準工作液的準確性有關。具體原因仍需進一步研究。

綜上所述，本研究建立了檢測血清睪酮的ID-LC-MS/MS候選參考方法。該方法精密度、準確度均較好，且操作相對簡便，分析時間短。臨床常規檢測方法（微粒子化學發光法）與ID-LC-MS/MS的相關性良好，但低濃度樣本2種方法之間偏差較大，仍需加強血清睪酮臨床常規檢測方法的質量控制。開展正確度驗證計劃是提升臨床血清睪酮檢測質量的有效方法。本研究建立的候選參考方法可在臨床血清睪酮檢測質量改善中發揮積極作用。