單寧酸抑制肺炎克雷伯菌生物膜形成的作用及其機制

周燕霞， 金東芳

（金華市人民醫院檢驗科，浙江 金華 321000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是引起院內感染的主要革蘭陰性菌，可誘發一系列疾病，包括血流感染、呼吸道感染以及肝膿腫，重癥監護病房中免疫功能受損的患者更易感染[1]。目前，碳青霉烯類抗菌藥物（亞胺培南和美羅培南）是治療肺炎克雷伯菌感染的主要藥物，但隨著此類藥物的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）開始出現，甚至使臨床面臨無藥可用的局面[2]。肺炎克雷伯菌可以形成生物膜，使抗菌藥物難以滲透入細菌內發揮殺菌作用。因此，迫切需要尋找新的化合物或植物提取物，以解決這一難題[3]。單寧酸是從植物組織中（如茶葉）提取的具有抗菌和抗病毒活性的化合物。有研究結果表明，單寧酸對大腸埃希菌生物膜形成有一定的抑制作用，但對CRKP的作用仍未知[4]。本研究旨在通過分析單寧酸抑制肺炎克雷伯菌生物膜形成的機制，為臨床控制CRKP感染提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集3株分離自2019年金華市人民醫院住院患者痰液樣本的CRKP（KP1、KP2、KP3）和1株碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（KP 13883），質控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC 13883）購自國家衛生健康委臨床檢驗中心。

1.2 儀器和試劑

熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；單寧酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；1%結晶紫粉末（美國Thermo Fisher Scientific公司）；S-3000N電子顯微鏡（日本HITACHI公司）。實時熒光定量PCR試劑盒（日本TOYOBO公司）；M-H肉湯（英國OXOID公司）；亞胺培南干粉、美羅培南干粉（上海廣銳生物科技有限公司）。

1.3 體外藥物敏感性試驗

采用微量肉湯稀釋法檢測3株CRKP和1株KP13883對2種常用碳青霉烯類藥物（亞胺培南和美羅培南）的敏感性。結果判讀根據美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2019標準[5]。

1.4 菌株生長能力測定

參照文獻[6]進行細菌生長能力測定。將3株CRKP和1株KP 13883接種到M-H瓊脂平板上，37 ℃條件下靜置過夜培養；用接種環挑取單個菌落于10 mL M-H培養基中，37 ℃、200 r/min條件下過夜培養。第2天按1∶100比例進行稀釋，以同樣條件進行亞培養，以加入8 mg/mL單寧酸的培養管為對照，每2 h測定1次600 nm處的吸光度（A600nm）值。

1.5 生物膜形成能力檢測

采用結晶紫染色法[7]測定生物膜形成能力。細菌在平板3區劃線生長后，挑取單個菌落于10 mL M-H肉湯中，37 ℃ 180 r/min過夜培養；吸取100 μL菌液至10 mL M-H肉湯中，再吸取10 μL加入含190 μL M-H肉湯的96孔板中，同時做3個復孔，以不加菌液的200 μL M-H肉湯作空白對照，同時以加入8 mg/mL單寧酸的培養管為對照。培養24 h后棄去浮游細菌，用磷酸鹽緩沖液洗2次，干燥后加入200 μL結晶紫染色10 min，棄去染液，加入250 μL無水乙醇，靜置10 min，吸取100 μL，用于測定A600nm，計算3個復孔的平均值。

1.6 掃描電子顯微鏡觀察

參照文獻[8]培養生物膜，選取生物膜形成能力相對較強的KP2進行此試驗。挑取單個菌落于10 mL M-H肉湯中，37 ℃過夜培養。棄去上清，重懸菌液并調至0.5麥氏濁度，按1∶100比例稀釋菌液，將不銹鋼片放入6孔板中，每孔加入2 mL稀釋后的菌液，37 ℃靜置培養24 h，使細菌在不銹鋼片上形成生物膜。以加入8 mg/mL單寧酸的培養管為對照。待生物膜形成后，棄去培養液，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，風干。向6孔板中加入2 mL 2.5%戊二醛固定生物膜。再分別用50%、70%、80%、90%、100%無水乙醇脫水10 min，干燥后鍍金，采用S-3000N電子顯微鏡掃描觀察。

1.7 生物膜相關基因表達量分析

選取生物膜形成能力相對較強的KP2進行生物膜形成相關基因的表達量分析。分別在含和不含單寧酸的條件下，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測生物膜相關基因（mrkA、luxS和wbbM）的表達量。引物參照文獻[9]進行合成。采用2－ΔΔCt方法計算生物膜形成相關基因的表達量，以肺炎克雷伯菌（ATCC 13883）為對照菌株，以rpoB為內參基因。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件對數據進行統計分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外藥物敏感性試驗結果

3株CRKP均對亞胺培南和美羅培南耐藥（MIC均≥64 μg/mL），1株KP 13883對2種藥物均敏感，MIC分別為0.25和0.5 μg/mL。

2.2 單寧酸對菌株生長速度的影響

3株CRKP在不含單寧酸的條件下均生長良好，12 h左右達到穩定期。在培養基中加入8 mg/mL單寧酸后，CRKP的生長均受到抑制，A600nm下降強度為2.0～3.0。單寧酸對敏感菌株KP13883也存在抑制作用。見圖1。

圖1 單寧酸對4株肺炎克雷伯菌生長能力的影響

2.3 生物膜形成能力分析

在不含單寧酸的條件下，肺炎克雷伯菌生物膜形成能力較強。但在培養基中加入8 mg/mL單寧酸時，形成的生物膜相對較少，A600nm下降強度約為1.5（P<0.05）。見圖2。

圖2 單寧酸對4株肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的影響

2.4 掃描電子顯微鏡形態觀察結果

掃描電子顯微鏡觀察結果顯示，在不含單寧酸的條件下，細菌生長良好，細菌之間相互聚集成群，遍布整個視野[圖3（a）]。當在培養基中加入8 mg/mL單寧酸時，細菌形成的生物膜量明顯減少，細菌散落地分布于視野中[圖3（b）]。

圖3 單寧酸對肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的影響電鏡觀察結果（×2 000）

2.5 生物膜相關基因表達量分析

加入與未加入單寧酸相比，群體感應相關基因luxS和脂多糖相關基因wbbM的表達量明顯下降（P<0.05）。與肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛編碼相關的操縱子基因mrkA略有上調，但差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4。

圖4 單寧酸對肺炎克雷伯菌生物膜形成相關基因表達量的影響

3 討論

肺炎克雷伯菌是一種條件致病性革蘭陰性有莢膜細菌，具有高耐藥性[10]。近年來，攜帶碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌逐漸增多，導致此類細菌感染患者的發病率和病死率明顯增加[11]。

SHAO等[4]發現，單寧酸對大腸埃希菌的生長及其生物膜的形成有一定的抑制作用，可作為一種新的抗菌化合物。本研究收集了3株CRKP，以1株碳青霉烯敏感菌株KP 13883作為對照，結果顯示，單寧酸對CRKP和碳青霉烯敏感株菌KP 13883的生長均有一定的抑制作用；進一步通過96孔板結晶紫染色法進行分析，發現單寧酸可以明顯抑制肺炎克雷伯菌生物膜生成，掃描電子顯微鏡觀察結果進一步證實了這一點。因此，單寧酸降低生物膜形成的機制可能是抑制細菌本身的生長。

為了進一步從分子角度分析單寧酸抑制肺炎克雷伯菌生物膜形成的機制，本研究對肺炎克雷伯菌生物膜形成相關基因的表達量進行了分析。結果顯示，單寧酸并未降低與肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛相關的基因mrkA的表達量[9]。然而，單寧酸可以明顯降低與群體感應功能相關的基因luxS和脂多糖相關基因wbbM的表達量[9]。這提示單寧酸可以降低細菌交流所需要的信號，使群體感應功能受到影響，減少細菌間交流，進而使生物膜形成的量減少。此外，單寧酸還可以通過降低脂多糖含量，使細菌的黏附能力降低，進而削弱其生物膜形成能力[9，12]。

綜上所述，單寧酸對肺炎克雷伯菌生物膜的形成能力有一定的抑制作用，其機制主要是通過降低群體感應功能相關基因luxS和脂多糖相關基因wbbM的表達量。本研究結論對控制和治療由CRKP引起的感染有一定的參考價值。