睪酮冰凍人血清國家標準品的研制

于 婷， 沈 敏， 曲守方， 孫 楠， 孫 晶， 黃 杰

（1. 中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所非傳染病診斷試劑室，北京 100050；2. 美康生物參考實驗室，浙江 寧波 315104）

睪酮是一種重要的雄激素，主要來源于睪丸間質細胞。在雄性睪丸、雌性卵巢以及腎上腺中均有分泌。睪酮在機體內具有維持生殖功能和第二性征、增強肌肉強度與質量、維持骨密度[1]等重要的生理作用。有研究結果表明，生理水平的睪酮對男性心血管系統有益，睪酮缺乏與心血管疾病的發生有關[2-3]。睪酮水平增高常見于尿毒癥、男性性早熟、先天性腎上腺皮質增生癥、前列腺腫瘤[4-5]等。睪酮水平降低常見于先天性睪丸發育不全或不發育、隱睪、性腺功能減退[6]等疾病。因此，準確測定血清中的睪酮水平，對于疾病的診斷、監測具有重要意義。目前，血清基質的睪酮國際標準品購買周期較長，且費用較高，而我國僅國家衛生健康委臨床檢驗中心制備過冰凍人血清睪酮標準品，但數量較少，遠不能滿足實際需求。因此，我們研制了人血清基質的睪酮國家標準品，以促進血清中睪酮測定的標準化。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

S40 SevenMulti綜合測試儀、XS205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；N-EVAP 24位氮吹儀（美國Organomation公司）；2XZ-1旋片式真空泵（臨海譚氏真空設備公司）；LC30AD-QTRAP5500超高效液相色譜-質譜聯用儀、AB5500液相色譜-質譜聯用儀（美國ABSCIEX公司）；TQ-S高效液相色譜-質譜聯用儀（美國Waters公司）；MS-C120全自動化學發光儀（寧波美康公司）；cobas 8000全自動免疫分析儀（瑞士羅氏公司）；IS1200全自動化學發光測定儀（四川邁克公司）。均勻性和穩定性評價用試劑盒：睪酮檢測試劑盒（化學發光免疫分析法，批號20180725，寧波美康公司）。互通性評價用試劑盒：血清睪酮檢測試劑盒[電化學發光法，批號353201，羅氏診斷產品（上海）有限公司]、睪酮測定試劑盒（化學發光法，批號0919031，四川邁克公司）。

1.2 方法

1.2.1 侯選品制備 收集外觀透明、清澈，無脂血、溶血和黃疸的血清，同時檢測乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體和梅毒螺旋體抗體，取4種病毒抗體檢測均為陰性的血清樣本，按照睪酮濃度的高低合并成2個不同水平的大樣，分別混勻后，進行多重過濾和除菌處理。將過濾后的血清按照0.5 mL分裝入1.5 mL棕色冷凍玻璃瓶。制備好的候選品于-70 ℃條件下保存。

1.2.2 均勻性分析 按照文獻[7-8]要求進行均勻性分析。在分裝的前、中、后各抽取10支候選品，采用MS-C120全自動化學發光儀進行測定，每支候選品均測定3次。

1.2.3 短期穩定性分析 按照文獻[9]要求進行短期穩定性分析。分別于第1、2、3、5、7、12、20、30 d 8個時間點從候選品Ⅰ、Ⅱ中各隨機抽取6支，分別在-20 ℃、（2～8）℃、（20～25）℃條件下各放置2支，各時間點的取樣時間保持一致，采用MS-C120全自動化學發光儀進行測定，每支候選品測定3次，求均值，中間穿插測定2個水平質控品。以各時間點為橫坐標，以候選品測定均值為縱坐標作圖，采用Excel 2010軟件進行線性擬合回歸分析，評價候選品穩定性的趨勢性變化，并計算斜率（k）、截距（b）和斜率（k）的標準差（sk），計算公式為：

在置信水平p=0.95、自由度為n-2的條件下，查t-分布界值表，得到對應的t（0.95，n-2）值。計算t（0.95，n-2）·sk的值，比較|k|值與t（0.95，n-2）·sk的值，如果|k|

1.2.4 聯合定值 要求參加定值的實驗室近2年睪酮項目參考實驗室外部質量評價計劃（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA）比對，或國內參考實驗室室間比對結果達到國際或國內參考實驗室及格標準，且數量不少于3家。定值方法均采用參考測量程序[10]。要求實驗前必須采用中國計量科學研究院純品標準物質或其他有證參考物質校準參考測量程序，同時測定質控物質。實驗分3批（次）進行。每批（次）分別依次測定有證標準物質-質控物質-2個水平候選品，每批（次）每個樣本平行處理3份，每份重復檢測3次，每個樣本最后得到9個數據，3批（次）每個樣本共收集27個數據。按照以下標準判定數據是否有效：（1）樣本測定結果應在±2s范圍內，和s分別是指全部實驗室所有結果的和s，且室內變異系數（coef ficient of variation，CV）≤5.0%；（2）質控物質測定結果應在靶值±5.0%范圍內，且室內CV≤5.0%。不滿足要求的數據為無效數據，直接剔除，取各實驗室2個水平候選品的有效數據的均值，合并計算總均值，作為該樣本的最終靶值。

1.2.5 不確定度分析 以Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement（GUM）為基礎，依據GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作原則（3）標準樣品定值的一般原則和統計方法》進行。不確定度來源包括均勻性、穩定性和定值。候選品的合成標準不確定度（uCRM）的計算公式為：

式中uchar為定值引入的標準不確定度，ubb為均勻性引入的標準不確定度，us為穩定性引入的標準不確定度。

1.2.6 互通性評估 依據文獻[11]，采用參考方法和常規方法同時對選定的一系列具有代表性的臨床血清樣本（通常不少于20份）和候選品進行檢測，采用通過2種方法測定臨床樣本的結果建立數學回歸關系。以參考方法測定值為X，以常規方法測定值為Y，用Origin 8.0軟件繪制散點圖。如果候選品常規方法的測定均值在該區間內，說明該候選品在該常規方法上無基質效應，其在參考方法和常規方法間具有互通性。

2 結果

2.1 均勻性分析結果

單因素方差分析結果顯示，睪酮候選品Ⅰ、Ⅱ的F值分別為1.448 5和1.569 6，均

表1 睪酮侯選品均勻性分析結果

2.2 穩定性分析結果

對睪酮候選品Ⅰ、Ⅱ進行3種溫度下30 d短期穩定性評價，候選品Ⅰ、Ⅱ在20～25℃放置30 d均不穩定，但在2～8 ℃及-20 ℃均可穩定30 d。減少時間點繼續分析候選品在20～25 ℃的穩定期限，結果顯示：20～25 ℃條件下，候選品Ⅰ可穩定5 d，候選品Ⅱ可穩定20 d。見表2、表3。

表2 睪酮候選品3種溫度短期穩定性分析結果

表3 睪酮候選品20～25 ℃短期穩定性分析結果

2.3 聯合定值結果

有3家實驗室參加了聯合定值。睪酮候選品Ⅰ、Ⅱ定值結果的實驗室內CV分別不高于3.2%、2.3%，表明各實驗室建立的參考方法穩定，數據可靠。見表4。

表4 睪酮候選品聯合定值結果

2.4 不確定度分析結果

2.4.1 定值引入的不確定度 定值引入的不確定度計算公式為：

式中s為全部實驗室測值的總s，p為實驗室總數。候選品I、Ⅱ定值引入的不確定度分別為0.007 5、0.032 2 ng/mL。

2.4.2 均勻性引入的不確定度 均勻性引入的不確定度計算公式為：

式中n為有效單元數。候選品I、Ⅱ均勻性引入的不確定度分別為0.019 1、0.035 6 ng/mL。

2.4.3 穩定性引入的不確定度 穩定性引入的不確定度計算公式為：

式中sk為穩定性數據經線性擬合得到方程的斜率（k）的s，x為候選品的有效期。睪酮候選品穩定性引入的不確定度結果見表5。

表5 睪酮候選品穩定性引入的不確定度

2.4.4 合成不確定度 候選品Ⅰ、Ⅱ的合成不確定度分別為0.025 1、0.078 1 ng/mL。經聯合定值及不確定度分析，睪酮候選品Ⅰ、Ⅱ的定值結果分別為（0.22±0.05）ng/mL（k=2）、（3.67±0.16）ng/mL（k=2）。

2.4.5 互通性評估 采用參考方法和2個不同常規方法同時測定不少于25份新鮮血清樣本，通過新鮮臨床樣本測定結果得到線性回歸方程，將參考方法測定均值為X軸，計算睪酮候選品的95%可信區間，結果顯示，該候選品常規方法測定值均位于該區間范圍內，侯選品具有良好的互通性。見表6。

表6 睪酮候選品的互通性評價結果

3 討論

樣本中睪酮的檢測方法包括氣相色譜、液相色譜、氣相色譜-質譜、高效液相色譜、高效液相色譜-質譜、同位素稀釋法。這些方法的檢出靈敏度很高，線性范圍較寬，但對操作人員、儀器等要求非常高；且耗時長，成本較高，因此并未在臨床上得到廣泛應用。

目前，臨床上最常用的是基于抗原抗體反應的化學發光法和酶聯免疫法，檢測速度快，且易于操作，已有幾十個品牌的商品化試劑盒。然而，各品牌試劑盒因溯源方法、校準品基質、抗原抗體等原料的選擇等不盡相同，測定值之間存在較大差異。同時，隨著睪酮臨床檢測的廣泛開展，以及我國對于試劑盒產品的溯源性要求越來越嚴格，市場對于睪酮標準物質的需求量較大，因此本研究制備了一批血清基質睪酮候選品。該候選品以人源血清為基質，不添加防腐劑和抗菌藥物，最大限度地保持了臨床樣本的特性。日常保存在-70 ℃條件下，運輸均采用干冰，從而可保證候選品的穩定性。該候選品均勻性和穩定性評價結果均為滿意，穩定性在一定使用條件下滿足要求，且互通性良好。根據ISO導則35[12]和國家標準物質技術規范，3個實驗室均采用參考方法對侯選品進行聯合定值。測量前對儀器進行校準、驗證和維護，并且對建立的參考方法進行了確認，以確保維持檢測能力，從而保證結果測定的可靠性。

總之，本研究制備的睪酮冰凍人血清侯選品，穩定性、均勻性、互通性良好，定值結果準確，可以作為國家標準品使用。該血清睪酮標準品將主要用于試劑盒研發過程的量值溯源、試劑盒產品注冊以及臨床常規檢測系統的正確度評價等，將促進臨床血清睪酮檢測結果的互認以及睪酮檢測試劑盒的監管。