沉積物氮模擬釋放過程中氨氧化菌群落變化

劉卓，楊代瓊，李姣，陸瑩，盧昶雨

(1.河北地質大學 實驗實踐教學中心，河北 石家莊 050031；2.河北地質大學 水資源與環境學院 河北省水資源可持續利用與開發重點實驗室 河北省水資源可持續利用與產業結構優化協同創新中心，河北 石家莊 050031；3.西安市市政設施管理中心，陜西 西安 710016；4.復旦大學 環境科學與工程系，上海 200433)

近年來，國內湖泊面臨著水質逐年惡化、富營養化日益嚴重等問題，除了磷之外，氮也是限制湖泊富營養化的主要因子[1]。當湖泊水體氮負荷較重時，部分形態氮會通過沉淀或者由顆粒物吸附而蓄存于沉積物中，使沉積物成為湖泊水體污染物的重要蓄積庫[2-6]。

針對湖泊沉積物界面氮交換通量問題的研究方法有質量衡算法、孔隙水擴散模型、表層沉積物模擬法、柱狀芯樣模擬法和水下原位模擬法[7]。各類方法對沉積物氮釋放通量的研究主要集中于營養鹽釋放通量流動培養[8]、釋放通量的估算[9]、釋放通量影響因素等[10]。其大部分均是針對沉積物-水界面氮釋放通量的單獨研究，氮釋放通量對微生物群落結構間的影響則相對較少。沉積物-水界面微生物群落中硝化細菌的群落結構與各形態氮釋放通量有著密切的關系，氨氧化細菌(AOB)是硝化細菌中最主要的細菌之一，其可將氨氮轉化為亞硝酸鹽，使得亞硝酸鹽繼續轉化為硝酸鹽[11-13]。

滇池海埂地區位于滇池草海和外海交界處，成為了滇池的一處藍藻聚集帶，污染相對較為嚴重。截止到采樣時間，整個區域被兩層圍隔圍成面積為0.5 km2的封閉區域。本研究通過對海埂地區沉積物氮釋放的模擬，研究氮釋放過程中釋放通量對沉積物-水界面氨氧化菌群落結構的影響，以期為研究及控制海埂地區水體富營養化提供基礎數據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

水樣、底泥、沉積物均取自滇池海埂；去離子水。

3 L有機玻璃水樣采集器；PSC-1/40彼得森挖泥器；Mobio Powersoil Isolation Kit試劑盒(100次/盒)；Applied Biosystems PCR擴增器；sds-page變性梯度凝膠電泳(DGGE)；S4 EXPLORER X-射線熒光分析儀。

1.2 樣品采集

對海埂區域內4個具有代表性的點位(見圖1)進行樣品采集，#1為技術集成示范區(湖泊內源污染控制技術集成區域)，僅進行了短時間的藍藻清除工作；#2為風浪較大區域；#3情況較為復雜，水深達3.5 m，位于兩層圍隔的航道之間，最外層圍隔并未把整個研究區圍成封閉式區域，因此#3的水體與外海水體之間有水質交換；#4為水位最深處，水深達4 m。

圖1 采樣點分布示意圖Fig.1 Position of sampling sites

采用3 L有機玻璃水樣采集器采集水樣，采水器內置溫度計，可現場讀出水溫，水樣均在24 h內帶回實驗室進行分析。底泥使用彼得森挖泥器進行采集，每個點位進行多次采泥，每次采集表層底泥4～6 L，放入干凈盆中混勻，裝入保溫箱中，24 h內帶回實驗室進行模擬實驗。

1.3 實驗設計

采用有機玻璃柱進行沉積物氮釋放通量的模擬實驗。有機玻璃柱下端封閉，上端帶有密封蓋子，沉積物(高度5 cm)灌入有機玻璃柱以后，通過虹吸法(防止底泥擾動)將去離子水緩慢注入有機玻璃柱，高度20 cm。實驗4個點位沉積物釋放模擬反應器分別放入恒溫培養箱。實驗開始后，每天采樣1次，每次采樣位置為水面下10 cm處，每次采完水樣，立即向玻璃柱中注入等量的去離子水；同時，采取模擬反應器表層沉積物樣品2～5 g，用于沉積物DNA提取。實驗持續41 d，每組實驗均設置3組平行。

1.4 實驗方法

1.4.1 DNA提取 根據Mobio Powersoil Isolation Kit試劑盒的操作說明，對沉積物樣本進行基因組DNA抽提。

1.4.2 PCR擴增 AOB的PCR擴增采用引物為CTO189fAB-GC(CCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGAGRAAAGCAGGGGATCG)、CTO189f C-GC(CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGAGGAAAGTAGGGGATCG)和CTO654r(CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC)[14-15]，40 μL的反應體系組成如下：20 μL BioLinker 2×Taq Mix，引物上游各1 μL，引物下游1 μL，模板1 μL 和適量的雙蒸水補足40 μL。反應條件：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s； 56.4 ℃，30 s；72 ℃，30 s，30個循環，最后在72 ℃下延伸5 min。

1.4.3 變性梯度凝膠電泳 (1)將20 μL PCR產物加入到8%(w/v)的聚丙烯酞胺凝膠(37.5∶1)中，凝膠的變性范圍為40%～60%[本研究中凝膠的100%變性為含有7 mol尿素和40%(v/v)的去離子甲酰胺(deionized Formamide)聚丙烯酰胺凝膠]；(2)將Bio-Rad制膠裝置傾斜放置，通過Bio-Rad Model475 Gradient Delivery System灌膠系統以從頂部注入凝膠的填充方式進行梯度灌膠；下層膠凝固1～1.5 h后，灌上層0%膠；凝膠灌制完畢后，插入梳子；放置1～1.5 h，待膠凝固后，移除梳子，將凝膠裝置放于Bio-Rad水浴系統中，使溫度保持60 ℃；(3)電泳條件為：溫度60 ℃，電壓80 V，緩沖液l × TAE，電泳時間16.5 h，電泳完畢后，取出凝膠裝置，置于磁鋼容器中，加入400 mL Biolinker DNA Red染色液進行染色40 min；(4)置于Bio-Rad凝膠成像系統中觀察拍照，進行凝膠影響分析。

1.4.4 樣品指標的測定 水樣中各形態氮濃度采用國標法《水和廢水檢測分析方法(第四版)》[16]測定；沉積物中TN過硫酸鉀消解法測定；底泥的pH值通過質量與體積比1∶2.5的泥和水(0.01 mol/L KCl溶液)混合后測定渾濁液中的pH值[17]；底泥中有機質(OM)含量通過樣品在550 ℃下煅燒4 h，樣品質量差進行測定[18]；樣品的金屬氧化物成分通過X射線熒光分析儀來測定。

1.5 數據分析

1.5.1 底泥各形態氮釋放通量 采用公式(1)和(2)進行計算[19]。

(1)

(2)

式中Mn——每次測定期內的釋放量,mg；

V——泥樣上覆水的體積,L；

Cn——第n次采樣時水中營養鹽濃度,mg/L；

C0——泥樣上覆水的初始營養鹽濃度,mg/L；

Vn——每次采集水樣體積,L；

N——采樣次數。

1.5.2 香農指數(Shannon) 用來估算樣品中微生物的多樣性指數之一，其公式為：

(3)

H為香農指數，S為DGGE膠中條帶數量，Pi為第i條帶灰度占該樣品總灰度的比率。豐富度指數(S)即為某個樣本中所有條帶的總和。

1.5.3 均勻度指數(E) 用來描述群落中個體數量在物種中的分布均勻狀況，亦是群落多樣性指數之一，其公式為[20]：

E=H/Hmax=H/lnS

(4)

1.5.4 辛普森指數(D) 用來測定群落中物種多樣性指數之一，其公式為[21]：

(5)

式中Ni為物種個體數，N為總個體數。

同時采用Quantiy one對微生物群落DGGE圖譜進行分析、Canoco4.5用于主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)，Mothur等軟件開展基于PCR-DGGE技術的氨氧化菌群落多樣性研究。

2 結果與討論

2.1 沉積物理化性質及各形態氮含量分析

4種沉積物的理化性質見表1。

表1 4種沉積物的理化特性(均值±標準誤差)Table 1 Physicochemical properties(mean value± standard deviation) of four sediments

由表1可知，相比其他點位沉積物，#3沉積物中TN含量較高，其可能造成該點位較高的氮釋放通量。有研究指出[22-24]，較高的有機質和金屬氧化物含量有利于沉積物對各形態氮的吸附，因此會導致上覆水中氮含量的減小，其中#1沉積物含有較高的金屬氧化物含量，該點位沉積物對上覆水中各形態氮有較強的吸附能力，可能會影響實驗中沉積物氮的釋放。沉積物中pH會影響AOB群落結構，AOB最適生長pH為7.5～8.0，因此，#2和#3沉積物中AOB群落多樣性會相對較高。

2.2 沉積物氮釋放通量

見圖2(a)，NH4-N釋放通量在實驗第1 d達到最高值1.25 mg/(m2·d)，且#3的NH4-N釋放通量遠大于其他三個點位底泥的釋放通量，這可能由于該點位沉積物TN含量最高所導致。此外，在第25 d，NH4-N的釋放通量幾乎接近0 mg/(m2·d)，這說明在25 d時，底泥已不再向上覆水釋放NH4-N，且上覆水中NH4-N的濃度也較低；由圖2(a)可知，在底泥NH4-N釋放過程中，NH4-N的釋放通量在0～7 d是快速減小階段，在8～25 d內，其釋放通量是緩慢減小階段，直至趨于0；當釋放通量接近于0時，這表明上覆水中的NH4-N濃度也處于一個相對低的狀態，這可能是由于在整個模擬底泥釋放的系統中，底泥表層的硝化菌，尤其是AOB在起作用。

由圖2(b)可知，#2的NO2-N釋放通量在第4 d達到了最高，0.03 mg/(m2d)，其他3個點位底泥均在第5 d時釋放通量達到最高，依次為#3[0.09 mg/(m2d)]>#4[0.04 mg/(m2d)]>#1[0.035 mg/(m2d)]，其中#3沉積物NO2-N的釋放通量最大，在第6～15 d內，NO2-N的釋放通量又迅速下降，趨向平衡。NO2-N的釋放通量呈現先增加后減小的趨勢，這主要是由于實驗開始階段，沉積物向上覆水釋放大量的NH4-N，經過一定時間，NH4-N被氧化成NO2-N，在反應器內，AOB是導致該現象的主要原因。

圖2 NH4-N和NO2-N釋放通量的變化曲線Fig.2 Changes of NH4-N and NO2-N fluxes

2.3 氮釋放過程中AOB多樣性指數變化

4個點位在不同時間點AOB群落結構的多樣性指數見表2。

由表2可知，#1的Shannon Wiener指數呈現一個先增后減的趨勢，在第13 d時達到2.434，說明#1的AOB數量和種類達到一定程度“飽和”后開始下降。#2的Shannon Wiener指數在第4 d時達到最大值2.280，這可能是因為#2的底泥性質導致AOB的繁殖速度較快所造成。#3的Shannon Wiener指數較小，在1.446～1.887之間，且前13 d內，指數大小變化不大(約為1.5)，在第21 d時，指數大小迅速增大，說明AOB群落的多樣性上升。#4的Shannon Wiener指數所呈現的規律與#3相似，前13 d指數大小在2.005～2.170之間，變化不大，第21 d時指數大小增加至2.341，說明AOB群落的多樣性上升。Simpson指數亦是反映群落多樣性的一項指標，見表2，Simpson指數與Shannon Wiener指數的變化趨勢基本一致。

表2 AOB多樣性指數表Table 2 Diversity values of AOB

豐富度指數是指樣品中所有條帶數總和，由表2可知，第13 d時，#1的豐富度指數最大，即條帶數最多，此時#1的樣品中AOB物種數量最多，這也從側面反映了#1在第13 d的AOB群落的多樣性最高，和Shannon Wiener指數變化所呈現的趨勢一樣。#2的豐富度指數在16～18之間，變化不大，AOB物種數量變化較小。#3在前13 d內，各樣品條帶數相同，說明物種數量基本不變，在第21 d時，條帶數量迅速上升，說明#3樣品中AOB物種數量增加，群落多樣性也隨之發生變化。#4的豐富度指數則呈現一個上升的趨勢，物種數量也穩步增加。

2.4 氮釋放過程中AOB的DGGE圖譜分析

氨氧化菌DGGE電泳圖見圖3(a)，從第1 d起，到第9 d，AOB條帶總數、種類及灰度都發生了較大的變化，尤其是第9 d到第21 d過程中，條帶數遠大于前5個時期，說明在第21 d時，4個點位泥-水界面AOB的群落較為豐富，且結構發生了較大的變化。同時部分條帶的灰度增大也說明了相關種群在泥-水界面占據了一定優勢。在沉積物氮釋放的前9 d，NH4-N的釋放通量大幅度減小，除#3沉積物，其他3個點位沉積物NH4-N的釋放通量在第9 d 時均趨向于0，沉積物-水界面AOB活躍，因此1～13 d的AOB條帶總數變化較大。9～21 d期間，可能是由于硝化菌中的亞硝酸鹽氧化菌的活躍導致條帶數的增多。

見圖3(b)，相較第21 d時AOB群落結構，#1、#2、 #3和#4均在第6 d時菌群結構變化最大，與第21 d 的相似度分別降至58.9%，76.9%，69.5%，57.6%；#1、#2、#3和#4底泥在第1，4，6，9 d菌群結構變化較為平緩，AOB種群結構無明顯變化，在前9 d 的4個時間段與第21 d的相似度分別維持在58%～65%，76%～79%，69%～74%和57%～69%，這表明在9 d以內，不同種類的AOB在適應環境變化的此消彼長，9 d以后，AOB種群結構發生變化，這也是導致前9 d NH4-N的釋放通量快速減小，NO2-N的釋放通量先增加后減小，變化不穩定的主要原因之一；此外，#1和#4，在整個實驗過程中，前9 d的AOB菌群結構與第21 d相比變化較大，主要是由于這兩個點位沉積物pH值較低，迫使AOB群落不斷適應環境而導致結構變化。

圖3 氨氧化菌DGGE凝膠電泳圖像(a)和經過Quantity One處理過后的電泳圖(b)Fig.3 DGGE pattern of AOB(a) and DGGE pattern after the treatment by Quantity One(b)1～6樣品分別表示第1，4，6，9，13，21 d樣品

2.5 氮釋放過程中AOB群落PCA和RDA分析

圖4(a)為各點位AOB主成分分析，第一主成分可以解釋總變量的57.2%，第二主成分可以解釋總變量的20.4%，兩個主成分共同解釋隨時間AOB群落變化的77.6%。4個點位的AOB群落結構在圖上分別成簇出現，同一點位各時間段樣品在主成分1和2上無明顯差異，各點位之間在主成分1和2上表現差異明顯。#3與其他3個點位在主成分1上有顯著差異，說明#3沉積物-水界面AOB對主成分1代表的群落分布結構與其他3個點位不同。#2和#4沿PC2軸兩端分布，#2和#4兩個點位群落在主成分2上有顯著差異，說明#2泥-水界面AOB對主成分2代表的群落分布結構與#4不同[25-26]。

將DGGE圖譜數字化的4個點位各時間段AOB群落信息與實驗系統中氨氮、亞硝氮、硝氮、pH和時間(Day)這5個外界環境因子進行冗余分析，考察不同點位不同時間段AOB和NOB與環境因子變量之間的關系。分析結果見圖4(b)，用箭頭表示各個環境因子，不同形狀的圖形表示不同點位樣品的群落結構信息，箭頭的長度表示AOB群落結構與該環境因子相關系數的大小，連線越長，相關性越高；箭頭和排序軸所構成的夾角大小表示箭頭代表的環境因子與排序軸相關性大小，夾角度數越小，相關性越高，箭頭所處的象限表示該環境因子與排序軸相關系數的正負。

圖4 4個點位沉積物實驗期間AOB群落多樣性PCA(a)和RDA(b)分析Fig.4 PCA(a) and RDA(b) of AOB community diversity for four sediments

由圖4(b)可知，本研究中，RDA分析結果的雙序圖表明了各環境因子對各點位各時間段樣品的影響：#4的大部分時間點樣品(組Ⅰ)受到了NH4-N的顯著影響，#2的4～21 d的時間點和#3的13～21 d 時間點樣品(組Ⅱ)主要受到pH和NO3-N的影響，且受pH影響顯著，#3的1～9 d和#1各樣品(組Ⅲ)受到了NO2-N的影響，但影響不顯著。

第一軸能解釋AOB群落結構異變的28.4%，反映AOB群落結構和環境因子的相關系數為0.814；第二軸能解釋AOB群落結構異變的9.3%，反映AOB群落結構和環境因子的相關系數為0.753，前兩軸解釋群落結構變化達到37.7%。#2和#4各時間段樣品分別位于第一軸左右兩端，說明#2和#4各時間點對環境適應的特點上相似；#1位于第二軸下端；#3則交替沿第二軸分布，說明#3各時間點樣品適應環境的能力不同。NH4-N和pH與群落結構之間呈現了較好的相關性，數值分別為0.549 5和-0.472 1，通過Monte Carlo法檢驗后顯示，p值分別為0.02和0.016，皆達到顯著水平(p<0.05)。NO2-N、NO3-N和時間與AOB群落結構相關性較低，且沒達到顯著水平(p>0.05)。根據最大相關性得出結論，pH和NH4-N對AOB群落分布結構影響顯著[27-28]。

3 結論

底泥表層AOB群落結構隨著各形態氮釋放通量變化而不斷變化；PCR-DGGE技術分析發現，隨著時間的變化，AOB群落在第9 d或13 d群落多樣性最豐富，這也是實驗模擬過程中，NH4-N釋放通量在開始的前9 d迅速減小，NO2-N釋放通量在13 d內濃度達到最高值的主要原因；4個點位的AOB群落結構在圖上分別成簇出現，同一點位各時間段在主成分上無明顯差異；pH和NH4-N對AOB和NOB群落分布結構影響顯著。