普通煙草脂氧合酶基因家族鑒定及表達模式分析

李志遠，宋青松，劉江，王德勛，范志勇，吳新儒，李曉旭，王奇，孫晉浩，郭存，晁江濤，李功博，劉貫山

摘? 要：脂氧合酶（LOX）是脂肪酸代謝途徑的關鍵酶，在植物的生長發育及多種逆境脅迫響應過程中發揮重要作用。本研究對煙草基因組中的LOX家族成員進行鑒定，并利用進化分析、共線性分析和表達分析等方法解析LOX家族成員的潛在生物學功能。結果表明，在普通煙草中共鑒定得到18個LOX基因，其中12個LOX基因被錨定在染色體上。系統進化分析表明，普通煙草中新鑒定的LOX家族成員被分為9-LOX和13-LOX兩個亞家族，其中13-LOX又可被分為Type I和Type II兩個亞類。共線性分析表明，煙草NtLOX07、NtLOX10基因分別與擬南芥AtLOX05、AtLOX01基因形成同源基因對，并且大部分同源基因之間具有相似的表達模式。表達模式分析發現，普通煙草LOX基因表達具有一定的組織特異性，并且NtLOX06等基因能夠被機械損傷和茉莉酸甲脂（MeJA）處理顯著誘導。因此，普通煙草LOX家族成員可能在植物脅迫響應過程中發揮著重要的作用。

關鍵詞：煙草;脂氧合酶;機械損傷;茉莉酸甲脂;表達模式

Identification and Expression Analysis of the Lipoxygenase Gene Family in Tobacco （Nicotiana tabacum L.）

LI Zhiyuan1， SONG Qingsong2， LIU Jiang3， WANG Dexun4， FAN Zhiyong4， WU Xinru1， LI Xiaoxu1，5，

WANG Qi1， SUN Jinhao1， GUO Cun1， CHAO Jiangtao1， LI Gongbo1， LIU Guanshan1*

（1. Key Laboratory of Tobacco Gene Resources， Institute of Tobacco Reserch of CAAS， Qingdao 266101， China; 2. Feixian Branch， Linyi Tobacco Company of Shandong， Feixian， Shandong 273400， China; 3. China Tobacco Shandong Industrial Co.， Ltd.， Jinan 250014， China; 4. Dali Branch， China Tobacco Yunnan Industrial Co.， Ltd.， Dali， Yunnan 671000， China; 5. China Tobacco Hunan Industrial Co.， Ltd.， Changsha 410007， China）

Abstract： Lipoxygenase （LOX） is a key enzyme in fatty acid metabolism of plant and plays multiple roles in development and stress responses. The identification and analysis of LOX family members in tobacco can provide a theoretical basis for tobacco resistance breeding. In the current study， a total of 18 LOX family members were identified in tobacco， and 12 of those were anchored on chromosomes successfully. The phylogenetic analysis revealed that the newly identified tobacco LOX family members could be divided in 2 subgroups （9-LOX and 13-LOX）. And then， LOX members in the 13-LOX subgroup could be classified in two different types （Type I and Type II）. The syntenic analysis revealed that there were two homologous gene pairs between Arabidopsis and tobacco， and they shared similar expression patterns. Notably， the expression pattern analysis indicated that the NtLOX genes expression patterns were different in tested tissues， while several NtLOX genes could be induced by wounding and MeJA treatments， such as NtLOX06. Therefore， LOX family members in tobacco may play a significant role in the process of plant stress response.

Keywords： tobacco; lipoxygenase; wounding; MeJA; expression pattern

植物脂肪酸代謝途徑產生的多種代謝產物在植物生長發育、抵御外界逆境脅迫和防衛反應中發揮著重要作用[1-4]。脂肪酸代謝途徑中關鍵基因的鑒定與分析對于解析植物脅迫響應的分子機制具有重要的意義。脂氧合酶（LOX）是脂肪酸代謝途徑的第一個酶也是該途徑的關鍵酶，屬于含非血紅素鐵的一類雙加氧酶，根據其在催化反應中加氧位置的不同，脂氧合酶可分為兩大類：9-LOX和13-LOX，分別在C-9（9-HPs）和C-13（13-HPs）位置引入氧原子[5-6]。另一方面，根據脂氧合酶亞細胞定位結果及序列相似性可將其分為兩種類型，其中不含質體轉運肽并且序列相似性大于75%的為Type I型，帶有假定的質體轉運肽并且序列相似性在35%以上的為Type II型。迄今為止，所發現的Type I型LOX均屬于13-LOX[7]。

脂氧合酶催化形成的脂肪酸氫過氧化物（HPs）可進一步形成其他代謝產物。其中一條途徑是從丙二烯氧合酶（AOS）開始的，然后通過一系列酶的修飾最終形成茉莉酸（JA）[8]。茉莉酸作為一種植物重要的信號分子，不僅參與生長和發育過程，還參與介導植物對食草動物和微生物病原體的防御反應[9]。另一條路線則是通過氫過氧化物裂解酶（HPLs）催化脂肪酸氫過氧化物（HPs）裂解形成C6-和C12-化合物，隨后生成相應的綠葉揮發物（GLVs）[10]。綠葉揮發物被報道參與植物防御反應，誘導相關防御響應基因表達的同時也對病原菌、害蟲具有直接或間接的抑制作用[11]?？梢?，脂氧合酶在植物對外界環境的防御反應中發揮著重要作用。

目前，LOX基因家族成員已在擬南芥[12]、番茄[13]、獼猴桃[14]、甜瓜[15]和楊樹[16]等多種植物中得到鑒定。在擬南芥中共鑒定得到6個不同的脂氧合酶基因，其中AtLOX01參與葉片中病原體的防御反應[17];AtLOX02參與茉莉酸（JA）的生物合成[18];AtLOX03和AtLOX04在花發育和雄性育性調控中發揮重要作用[19];AtLOX05參與植物側根發育和防御反應[20];AtLOX06在根中表達并參與茉莉酸（JA）的合成[21]。前人在漸窄葉煙草（Nicotiana attenuata）中鑒定到3個不同的脂氧合酶基因，其中NaLOX01屬于9-LOX家族，在根中特異表達[22];NaLOX02和NaLOX03屬于13-LOX家族，主要在地上部的組織中表達;NaLOX02主要與綠葉揮發物的合成相關而NaLOX03則參與茉莉酸的生物合成[23-24]。

煙草是一種重要經濟作物，由外界環境引起的生物和非生物脅迫對煙草品質及產量有重要影響。在四倍體普通栽培煙草LOX基因家族成員的鑒定與功能研究尚未見報道。為解析脂氧合酶基因在煙草生長發育和脅迫響應中的作用，本研究根據普通栽培煙草K326的基因組數據，利用比較基因組學和生物信息學手段，對煙草基因組中的脂氧合酶基因進行鑒定與分析，為闡明煙草逆境脅迫響應的分子機制和脂氧合酶家族成員的功能解析奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

普通煙草品種K326保存并于2020年4月在煙草行業基因資源利用重點實驗室內種植。實時熒光定量PCR儀采用美國Applied Biosystems公司的ABI 7500型號。激光共聚焦顯微鏡是來自德國Leica公司的TCS-SP8型號。RNA提取及反轉錄和熒光定量試劑盒購自艾克瑞（湖南）有限公司。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 煙草LOX基因家族成員的鑒定與分析? 在NCBI數據庫下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）和番茄（Lycopersicon esculentum L.）、水稻（Oryza sativa L.）、大豆（Glycine max）、大麥（Hordeum vulgare L.）和漸窄葉煙草（Nicotiana attenuata）的LOX家族成員的蛋白質序列。利用茄科基因組數據庫（http：//solgenomics.net/）下載煙草全基因組蛋白質序列。以擬南芥和番茄的LOX蛋白質序列為種子序列，進行本地BLASTP檢索（E-value<0.01），獲得候選序列。利用Pfam數據庫（http：//pfam.sanger.ac.uk/）和SMART數據庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對候選序列進行篩選[25-26]，去除不含有Lipoxygenase結構域的序列，其余普通煙草LOX成員根據其染色體定位信息進行命名。使用ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）工具，在線分析NtLOX家族成員的分子量和理論等電點[27]。

1.2.2? 系統進化分析? 使用MAFFT軟件對擬南芥、番茄、水稻、大豆、大麥及野生煙草LOX家族成員和新鑒定的普通煙草LOX家族成員的蛋白質序列進行多序列比對[28]。基于多序列比對的結果，使用MEGA X軟件采用鄰接法（NJ）構建系統進化樹，Bootstrap檢驗值設置為1000次[29]。

1.2.3? 基因結構及保守基序分析? 使用MEME工具（http：//meme.sdsc.edu/meme）檢測煙草LOX家族成員的保守基序，參數設為：待檢測保守基序數為15，基序長度最小為6個氨基酸，最長為50個

氨基酸[30]。從茄科基因組數據庫（http：//solgenomics. net/）下載煙草LOX家族成員的CDS和基因組序列，并將其上傳至GSDS網站（http：//gsds.cbi.pku. edu.cn/）用于生成煙草LOX家族成員的內含子/外顯子結構圖[31]。

1.2.4? 啟動子分析? 截取煙草LOX基因上游2000 bp序列作為啟動子區，在煙草全基因組數據庫中下載啟動子序列。將獲得的啟動子序列提交至PlantCare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網站鑒定煙草LOX基因啟動子區域上存在的順式元件[32]。

1.2.5? 共線性分析? 利用TBtools軟件對擬南芥和普通煙草K326全基因組序列進行比對。根據比對結果，利用McScan X軟件分析擬南芥和普通煙草基因組之間的共線性區塊，建立擬南芥和煙草之間的同源基因對，隨后使用TBtools軟件進行可視化展示[33-34]。

1.2.6? 轉錄組數據處理及結果分析? 普通煙草K326不同組織的轉錄組數據下載自NCBI的GEO數據庫（登錄號：GSE95717）[35]。在轉錄組數據中提取煙草LOX基因在根、莖和莖尖的表達數據并進行標準化，利用TBtools軟件中的HeatMap程序進行可視化分析。

1.2.7? K326脅迫處理? 普通煙草品種K326于2020年4月在中國農業科學院煙草研究所的培養室內培養（光周期16/8 h，25 ℃）。選取出苗后8周的煙草植株進行非生物脅迫處理[36]。使用95%乙醇按1：10稀釋MeJA，然后用含有0.1% Triton X-100

的蒸餾水進一步稀釋至終濃度為100 μmol/L。對煙草幼苗進行噴施處理。選取煙草幼苗第3片葉（由基部至頂部）為處理葉，使用消毒的手術刀片沿葉脈對稱劃4道傷口進行機械損傷處理。分別在MeJA和機械損傷處理后0、1、3、6 h采集組織樣品，并轉移至液氮或?80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.8? 煙草總RNA提取和反轉錄? 將采集的脅迫處理的樣品在液氮中研磨成粉末，使用Trizol試劑提取各樣品的總RNA，使用2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA質量和純度。隨后利用PrimeScript RT reagent Kit進行cDNA第一鏈的合成，將反轉錄后的cDNA置于?20 ℃保存。

1.2.9? 表達模式分析? 根據NtLOX基因的CDS序列，使用Primer 3 Plus在線程序設計qRT-PCR引物，隨后通過NCBI中的Primer-blast工具進行引物特異性檢測（表1）。使用ABI 7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）進行qRT-PCR檢測。以煙草核糖體蛋白基因L25（GenBank No. L18908）為內參，并進行了3個生物學重復，試驗結果分析采用2-ΔΔCt方法[37]。

2? 結? 果

2.1? 煙草LOX基因鑒定及理化性質分析

以擬南芥、番茄和馬鈴薯中已公布的LOX家族成員的蛋白序列為種子序列，進行本地BLASTP檢索，獲得候選煙草LOX家族成員。隨后利用SMART和Pfam數據庫對候選LOX家族成員的結構域進行分析，去除不含有LOX結構域的序列，最終鑒定到18個煙草LOX家族成員。

根據英文縮寫將煙草LOX簡寫為NtLOX，并依據煙草LOX基因的染色體定位信息對其進行命名（NtLOX1-NtLOX18）。新鑒定的18個煙草LOX基因中有12個被錨定在8條不同染色體上，分別分布在2、5、6、7、9、12、19、22染色體上。通過ProtParam工具分析煙草LOX家族成員的理化性質，結果表明，新鑒定的煙草LOX家族成員的長度在719～1693個氨基酸之間，蛋白分子量則介于81.21～192.21 kDa之間。同時，新鑒定的煙草LOX家族成員蛋白理論等電點在5.27～8.49之間（表2）。

2.2? 系統進化分析

為明確煙草LOX基因家族的進化關系，對煙草LOX家族成員和已報道的其他物種LOX家族成員的蛋白質序列進行多序列比對，并利用MEGA X軟件進行系統進化分析（圖1）。系統發育分析表明，煙草LOX家族成員被劃分為9-LOX和13-LOX兩個亞家族，根據序列相似性及是否含有質體信號肽將13-LOX分為Type I和Type II兩種類型。Type I型13-LOX亞類包含兩個成員（NtLOX09和NtLOX12），而Type II型13-LOX亞類包含3個成員（NtLOX06、NtLOX14和NtLOX18），剩余LOX家族成員則隸屬于9-LOX亞家族。單子葉植物和雙子葉植物中的9-LOX家族成員被分為兩個不同的類群。

2.3? 煙草NtLOX基因結構及保守基序分析

利用GSDS工具對煙草LOX基因的內含子/外顯子的組成進行了鑒定（圖2B）。結果顯示，在9-LOX亞家族中，除了NtLOX05和NtLOX11含有18個外顯子，剩余大部分9-LOX亞類成員含有的外顯子數為9至12個。Type I型13-LOX亞類中NtLOX09和NtLOX12均含有9個外顯子。Type II型13-LOX亞類中NtLOX06基因長度超過25 kb，共含有17個外顯子，而NtLOX14和NtLOX18僅含有8個外顯子。

為探究18個NtLOX家族成員的潛在功能，利用MEME保守基序進行分析工具對LOX家族成員的蛋白序列進行分析（圖2C）。結果表明，Motif 1（LOX結構域）在煙草NtLOX家族成員中高度保守，包括一段由38個氨基酸組成的富含組氨酸結構（His-X4-His-X4-His-X17-His-X8-His），該結構在維持脂氧合酶結構穩定性上發揮著重要的作用。所有的NtLOX家族成員均含有典型的LOX結構域，其中NtLOX05和NtLOX11含有2個LOX結構域。

2.4? 普通煙草LOX家族成員的共線性分析

為對煙草NtLOX基因的潛在生物學功能進行分析，本研究通過共線性分析建立擬南芥與煙草之間的同源基因對（圖3）。分析結果表明，普通煙草NtLOX07與擬南芥AtLOX05為同源基因對，普通煙草NtLOX10與擬南芥AtLOX01為同源基因對。

2.5? 普通煙草LOX家族成員的啟動子分析

為了研究煙草NtLOX基因的表達調控規律，利用PlantCARE在線工具對18個NtLOX基因啟動子區的順式作用元件進行了分析（圖4）。結果表明，在7個NtLOX基因（NtLOX01、NtLOX04、NtLOX10、NtLOX12、NtLOX13、NtLOX14和NtLOX15）的啟動子區域檢測到發育相關順式作用元件，例如分生組織發育相關元件（CAT-box）。同時，在一些NtLOX基因的啟動子區還存在激素響應元件，包括ABRE、ERE和CGTCA-motif，它們分別介導植物對脫落酸（ABA）、乙烯（ETH）和茉莉酸甲酯（MeJA）的響應。此外，在大多數NtLOX基因的啟動子區域中存在大量與逆境響應相關的順式作用元件，包括W-box、MYC、MYB、LTR、WUN-motif和ARE等。

2.6? 普通煙草LOX基因不同組織表達模式分析

利用普通煙草轉錄組數據[35]對NtLOX基因在不同組織的表達模式進行分析，結果（圖5）表明，煙草LOX家族編碼基因具有顯著的組織表達特異性。進一步的分析發現，NtLOX03、NtLOX05和NtLOX11等基因在測試組織中均有表達，但在莖尖中的表達量最高。同時，NtLOX02、NtLOX07、NtLOX10、NtLOX13和NtLOX16等基因特異性地在煙草根中表達。此外，NtLOX06基因在煙草莖尖和莖中高表達，而在根中沒有檢測到表達。

2.7? 普通煙草LOX基因脅迫處理下表達模式分析

為進一步解析煙草LOX家族成員的潛在功能，對18個煙草LOX家族成員在MeJA和機械損傷處理下的表達模式進行了分析。在MeJA處理下（圖6），NtLOX01、NtLOX02、NtLOX11和NtLOX15的表達量逐步升高并且在6 h達到最高，而NtLOX05、NtLOX09、NtLOX10和NtLOX16則呈現出逐漸下降的表達趨勢。此外，NtLOX04、NtLOX06、NtLOX07、NtLOX08、NtLOX13、NtLOX04和NtLOX17的表達量均呈現先升高后下降的趨勢。

在機械損傷處理下（圖7），NtLOX07、NtLOX11和NtLOX15的表達量逐漸升高并在處理后6 h達到峰值，而NtLOX01、NtLOX02、NtLOX03、NtLOX08、NtLOX13和NtLOX17的表達量均呈現出先升后降的趨勢。

在13-LOX的Type I型亞類中，NtLOX09經MeJA處理后下調表達且在3 h的表達量最低，而機械損傷處理則誘導其上調表達;NtLOX12在兩種處理后均下調表達。Type II型13-LOX中，NtLOX06、NtLOX14和NtLOX18經MeJA和機械損傷處理后均上調表達。其中NtLOX06在3 h的表達量最高，而NtLOX14表達量則在1 h最高隨后逐漸下降。

3? 討? 論

在植物中，脂氧合酶是脂肪酸代謝途徑的關鍵酶，并且在調控植株生長發育和脅迫響應中有著至關重要的作用。本研究在普通栽培煙草中鑒定到18個脂氧合酶基因，所有普通煙草LOX蛋白均含38個氨基酸殘基組成的高度保守的Lipoxygenase結構域。系統發育分析結果表明，普通煙草LOX蛋白可被劃分為9-LOX和13-LOX兩個亞家族。單子葉植物和雙子葉植物中的9-LOX基因被分為兩個不同的簇，表明這一分支可能是在單/雙子葉植物分化事件之后出現的?；蚪Y構及保守結構域分析表明，來自同一亞族的NtLOX成員具有相似的基因結構

和保守結構域組成，上述結果證明了系統進化分析的準確性。啟動子分析表明，在煙草LOX基因的啟動子區域含有大量的ABRE、G-box、W-box和MYB等脅迫響應元件，說明煙草LOX家族成員在煙草的多種逆境響應中發揮重要作用。

在擬南芥中，AtLOX05在根中高表達并且被證實影響側根的發育[20]。為探究煙草LOX家族成員在生長發育中的潛在功能，利用已公布普通煙草K326的RNA-seq數據對NtLOX基因在根、莖和莖尖的表達模式進行分析。結果表明，AtLOX05的同源基因NtLOX07同樣也在根中高表達，這表明NtLOX07基因可能參與煙草根系的生長發育過程。此外，AtLOX05參與擬南芥的免疫反應。在機械損傷和MeJA處理下，其直系同源基因NtLOX07均上調表達，表明NtLOX07基因同樣也具有免疫應答功能。特別地，擬南芥中AtLOX01參與葉片中防御反應[17]，但其直系同源基因NtLOX10在機械損傷和MeJA處理后均下調表達，暗示煙草中NtLOX10基因與擬南芥中AtLOX01基因可能出現了功能分化。

植物在自然環境中遭受病原菌或害蟲刺激后，會釋放防御信號分子綠葉揮發物。綠葉揮發物的釋放在MeJA介導的植物防御反應中發揮重要作用。前人在野生煙草中鑒定到控制綠葉揮發物合成的關鍵基因NaLOX02，該基因可受昆蟲取食或MeJA誘導[23]。系統進化分析表明，普通煙草中NtLOX06與野生煙草中NaLOX02聚在一起，并且該基因的表達受機械損傷和MeJA的誘導。上述結果表明，NtLOX06基因可能在普通煙草綠葉揮發物的合成過程中發揮重要作用。

4? 結? 論

本研究在普通栽培煙草中鑒定到18個脂氧合酶基因，所有普通煙草LOX蛋白均含38個氨基酸殘基組成的高度保守的Lipoxygenase結構域。同時，新鑒定的煙草NtLOX家族成員被分為9-LOX和13-LOX兩個亞家族，而13-LOX又可分為Type I和Type II兩類。共線性分析表明，煙草和擬南芥之間存在2個同源基因對，并且大部分同源基因之間存在相似的表達模式。表達模式分析表明，部分NtLOX家族成員存在組織表達特異性。普通煙草中多數LOX家族成員對機械損傷和MeJA處理均有響應，證明煙草LOX家族成員可能在植物防御反應中具有重要作用。

參考文獻

[1] BAILLY C， BOGATEK-LESZCZYNSKA R， C?ME D， et al. Changes in activities of antioxidant enzymes and lipoxygenase during growth of sunflower seedlings from seeds of different vigour [J]. Seed Science Research， 2002， 12（1）： 47.

[2] LELI?VRE J M， LATCH? A， JONES B， et al. Ethylene and fruit ripening[J]. Physiologia Plantarum， 1997， 101（4）： 727-739.

[3] KESSLER A， HALITSCHKE R， BALDWIN I T. Silencing the jasmonate cascade： induced plant defenses and insect populations[J]. Science， 2004， 305（5684）： 665-668.

[4] YAN L， ZHAI Q， WEI J， et al. Role of tomato lipoxygenase D in wound-induced jasmonate biosynthesis and plant immunity to insect herbivores[J]. PLoS Genet， 2013， 9（12）： e1003964.

[5] FEUSSNER I， WASTERNACK C. The lipoxygenase pathway[J]. Annual Review of Plant Biology， 2002， 53（1）： 275-297.

[6] SARDE S J， KUMAR A， REMME R N， et al. Genome-wide identification， classification and expression of lipoxygenase gene family in pepper[J]. Plant Molecular Biology， 2018， 98（4）： 375-387.

[7] BRASH A R. Lipoxygenases： occurrence， functions， catalysis， and acquisition of substrate[J]. Journal of Biological Chemistry， 1999， 274： 23679-23682.

[8] SCHALLER F， SCHALLER A， STINTZI A. Biosynthesis and metabolism of jasmonates[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2004， 23（3）： 179-199.

[9] BROWSE J. Jasmonate passes muster： a receptor and targets for the defense hormone[J]. Annual Review of Plant Biology， 2009， 60： 183-205.

[10] BATE N J， ROTHSTEIN S J. C6-volatiles derived from the lipoxygenase pathway induce a subset of defense-related genes[J]. The Plant Journal， 1998， 16（5）： 561-569.

[11] PROST I， DHONDT S， ROTHE G， et al. Evaluation of the antimicrobial activities of plant oxylipins supports their involvement in defense against pathogens[J]. Plant Physiology， 2005， 139（4）： 1902-1913.

[12] UMATE P. Genome-wide analysis of lipoxygenase gene family in Arabidopsis and rice[J]. Plant signaling and Behavior， 2011， 6（3）： 335-338.

[13] FERRIE B J， BEAUDOIN N， BURKHART W， et al. The cloning of two tomato lipoxygenase genes and their differential expression during fruit ripening[J]. Plant Physiology， 1994， 106（1）： 109-118.

[14] 張波. 獼猴桃脂氧合酶基因家族的功能解析及其調控[D]. 杭州：浙江大學，2007.

ZHANG B. Function and regulation of lipoxygenase gene family members in Kiwifruit[D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2007.

[15] 張沖. 甜瓜脂氧合酶基因家族成員鑒定、表達調控及CmLOX8在果實香氣合成中的作用[D]. 沈陽：沈陽農業大學，2016.

ZHANG C. Identification， expression and regulation of lipoxygenase gene family in melon （Cucumis melo var. makuwa Makino） and the role of CmLOX18 in synthesis of fruit aroma volatiles[D]. Shenyang ： Shenyang Agricultural University， 2016.

[16] CHEN Z， CHEN X， YAN H， et al. The lipoxygenase gene family in poplar： identification， classification， and expression in response to MeJA treatment[J]. PLoS One， 2015， 10（4）： e0125526.

[17] MELAN M A， DONG X， ENDARA M E， et al. An Arabidopsis thaliana lipoxygenase gene can be induced by pathogens， abscisic acid， and methyl jasmonate[J]. Plant Physiology， 1993， 101（2）： 441-450.

[18] BELL E， CREELMAN R A， MULLET J E. A chloroplast lipoxygenase is required for wound-induced jasmonic acid accumulation in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1995， 92（19）： 8675-8679.

[19] CALDELARI D， WANG G， FARMER E E， et al. Arabidopsis lox3 lox4 double mutants are male sterile and defective in global proliferative arrest[J]. Plant Molecular Biology， 2011， 75（1）： 25-33.

[20] VELLOSILLO T， MART?NEZ M， L?PEZ M A， et al. Oxylipins produced by the 9-lipoxygenase pathway in Arabidopsis regulate lateral root development and defense responses through a specific signaling cascade[J]. The Plant Cell， 2007， 19（3）： 831-846.

[21] GREBNER W， STINGL N E， OENEL A， et al. Lipoxygenase 6-dependent oxylipin synthesis in roots is required for abiotic and biotic stress resistance of Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2013， 161（4）： 2159-2170.

[22] ALLMANN S， HALITSCHKE R， SCHUURINK R C， et al. Oxylipin channelling in Nicotiana attenuata： lipoxygenase 2 supplies substrates for green leaf volatile production[J]. Plant， Cell & Environment， 2010， 33（12）： 2028-2040.

[23] VANDOORN A， KALLENBACH M， BORQUEZ A A， et al. Rapid modification of the insect elicitor N-linolenoyl-glutamate via a lipoxygenase-mediated mechanism on Nicotiana attenuata leaves[J]. BMC Plant Biology， 2010， 10（1）： 1-11.

[24] HALITSCHKE R， BALDWIN I T. Antisense LOX expression increases herbivore performance by decreasing defense responses and inhibiting growth-related transcriptional reorganization in Nicotiana attenuate[J]. The Plant Journal， 2003， 36（6）： 794-807.

[25] FINN R D， COGGILL P， EBERHARDT R Y， et al. The Pfam protein families database： towards a more sustainable future[J]. Nucleic Acids Research， 2016， 44（D1）： D279-D285.

[26] LETUNIC I， DOERKS T， BORK P. SMART： recent updates， new developments and status in 2015[J]. Nucleic Acids Research， 2016， 43： D257-60.

[27] GARG V K， AVASHTHI H， TIWARI A， et al. MFPPI-multi FASTA protparam interface[J]. Bioinformation， 2016， 12（2）： 74-77.

[28] KATOH K， KUMA K， TOH H， MIYATA T. MAFFT version 5： improvement in accuracy of multiple sequence alignment[J]. NucleicAcids Research， 2005， 33（2）： 511-518.

[29] 孫晉浩，牛文利，陳志華，等. 煙草NtbHLH112基因的克隆、鑒定及表達模式分析[J]. 中國煙草科學，2020，41（5）：8-14.

SUN J H， NIU W L， CHEN Z H， et al. Cloning， characterization and expression pattern analysis of NtbHLH112 gene in Nicotiana tabacum[J]. Chinese tobacco science， 2020， 41（5）： 8-14.

[30] BAILEY T L， BODEN M， BUSKE F A， et al. MEME SUITE： tools for motif discovery and searching[J]. Nucleic. Acids. Research， 2009， 37： W202-W208.

[31] HU B， JIN J， GUO A Y， ZHANG H， et al. GSDS 2.0： an upgraded gene features visualization server[J]. Bioinformatics， 2015， 31（8）： 1296-1297.

[32] LESCOT M， D?HAIS P， THIJS G， et al. PlantCARE， a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences[J]. Nucleic Acids Research， 2002， 30（1）： 325-327.

[33] WANG Y， TANG H， DEBARRY J D， et al. MCScanX： a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity [J]. Nucleic Acids Research， 2012， 40（7）： e49.

[34] CHEN C， CHEN H， ZHANG Y， et al. TBtools： an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular Plant， 2020， 13（8）： 1194-1202.

[35] EDWARDS K D， FERNANDEZ-POZO N， DRAKE-STOWE K， et al. A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency[J]. BMC Genomics， 2017， 18（1）： 1-14.

[36] 陳竹. 楊樹脂氧合酶（LOX）家族的全基因組分析及PtLOX11基因的功能研究[D]. 合肥：安徽農業大學， 2017.

CHEN Z. Genome-wide identification of lipoxygenase gene family in poplar and function analysis of PtLOX11 [D]. Hefei： Anhui Agricultural University， 2017.

[37] LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 （-Delta Delta C （T）） method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.