基于UPLC-Q-TOF-MS/MS結合網絡藥理學的壯腰通絡方延緩腰椎間盤退行性病變的化學成分及作用機制研究

孫凱，朱立國，2*，魏戌*，銀河，李秋月，秦曉寬，楊博文

本研究創新性：

本研究采用超高效液相色譜法—四極桿飛行時間串聯質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術初步闡明了壯腰通絡方中包含的化學成分，并進一步結合網絡藥理學方法解析了其藥效靶點、生物途徑及作用機制，為該方深入的藥效物質基礎和作用機制研究提供了參考依據。

本研究局限性：

壯腰通絡方中包含的化學成分十分復雜，通過高分辨質譜技術鑒定出的化學成分仍十分有限，且未明確鑒定出的化學成分是否均能進入體內發揮藥理作用。此外，盡管開展了網絡藥理學的預測分析，初步闡明了其可能的作用機制，但未能結合關鍵靶點及信號通路進行實驗驗證。

腰椎間盤退行性病變（lumbar intervertebral disc degeneration，LIDD）是導致腰椎退行性疾病發生的最重要的病理基礎。隨著社會老齡化的加劇，腰椎退行性疾病已成為嚴重危害人們生命健康的重大慢性疾病，且患病率呈現逐年上升的趨勢[1-2]，該類疾病具有遷延難愈、復發率及致殘率高等臨床特點。研究表明，2013年中國人群腰背痛所致傷殘損失壽命年為1 634.7萬人年，是中國人群傷殘負擔的第一原因，給人們帶來了極大的經濟負擔和精神壓力[3]。LIDD是該類疾病發生的核心環節，其病理機制涉及炎癥刺激、免疫應答、細胞凋亡等多種復雜生物學過程，因此，如何有效延緩椎間盤退變進程是國內外研究的熱點與難點[4-6]。

壯腰通絡方為首都名中醫朱立國教授基于長期臨床實踐凝練的有效經驗方。前期臨床觀察表明其能有效緩解腰椎間盤突出癥患者腰膝酸軟、疼痛不適等癥狀及改善日常活動受限等功能評分，4周治療有效率達82.22%，具有較好的安全性[7]。但在完成臨床療效觀察的基礎上，該方潛在的藥效物質基礎尚不清楚，且藥物的作用靶點、生物途徑及作用機制也未闡明。近年來，超高效液相色譜法—四極桿飛行時間串聯質譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC-QTOF-MS/MS）技術及網絡藥理學迅猛發展。UPLC-QTOF-MS/MS為快速鑒定中藥復方中所包含的已知化學成分及發現未知的化合物提供了有力的技術支撐，目前已廣泛應用于中藥化學成分檢測和表征的分析[8-10]。網絡藥理學在系統闡釋中藥復方、單味藥靶標及作用機制，解析藥物組合規律及中藥功效異同，了解疾病和證候的生物學基礎等方面發揮了重要作用，尤其是廣泛應用于中藥復方機制研究，為明確中藥復方多成分、多靶點、多途徑的分子作用機制提供了研究平臺[11-12]。

因此，本研究擬采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術結合網絡藥理學方法，基于“成分—靶點—通路”的網絡模式，初步揭示壯腰通絡方的有效成分及其治療LIDD的潛在作用機制，為該方進一步的實驗研究及臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究時間 2020年。

1.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS實驗儀器與試劑藥品

1.2.1 實驗儀器 液相系統為日本島津超高效液相色譜儀（Shimadzu LC30），質譜系統為SCIEX 5600+質譜儀（美國，AB Sciex Instruments，型號TripleTOF 5600+，Hybrid Quadrupole-TOF LC/MS/MS Mass Spectrometer），CPA225D電子分析天平〔賽多利斯科學儀器（北京）有限公司〕，SC-3160低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），ALC-M Tissue—Organ Bath System（上海奧爾科特生物科技有限公司）等。

1.2.2 試劑藥品 色譜純甲醇、質譜級甲醇、色譜級乙腈、質譜級乙腈〔購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司〕；分析純95%乙醇、分析純甲醇（北京化工廠）；甲酸為質譜純（美國Sigma公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）等。壯腰通絡方（由杜仲15 g、熟地黃15 g、當歸12 g、丹參12 g等9味中藥組成）藥物購于中國中醫科學院望京醫院，經鑒定為合格藥材，飲片質量符合《中華人民共和國藥典》2015年版（第十版）有關規定[13]。松脂醇二葡萄糖苷（批號：111537-201706，規格：20 mg）、地黃苷D（批號：112063-202001，規格：20 mg）、阿魏酸（批號：110773-201915，規格：50 mg）、丹參酮ⅡA（批號：110766-201721，規格：20 mg）等標準對照品均購于中國食品藥品檢定研究院（均符合國家藥品標準物質）。

1.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS實驗方法

1.3.1 壯腰通絡方供試品及對照品溶液制備 按照標準的湯劑提取工藝方法，將壯腰通絡方的中藥飲片放入容器內，加入8倍生藥量去離子水，充分浸泡30 min，大火煮沸后改小火煎煮40 min瀝出藥液至清潔容器，再次加入6倍藥量重的去離子水煎煮40 min濾出藥液，將兩次煎煮獲得的藥液混勻得到最終提取濾液，隨后采用旋轉蒸發儀減壓濃縮至小體積，用去離子水定容至生藥濃度0.1 g/ml，13 000 rpm離心15 min，取上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣分析。標準對照品溶液制備：用精密天平分別稱取標準對照品5 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇各自溶解、搖勻，定容，得到各標準對照品溶液母液，根據需要再用甲醇稀釋為所需濃度。

1.3.2 色譜條件和質譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC X Bridge? BEH C18 Column 2.5 μm，2.1 mm×50 mm；流動相：A為0.1%甲酸-水，B為乙腈，洗脫程序見表1。體積流量0.3 ml/min；柱溫為35 ℃，進樣器溫度為4 ℃，進樣量為10 μl。質譜條件：質譜采用正/負離子模式（ESI+/-）、IDA模式，掃描范圍m/z 50～1 500，掃描時間0.2 s，碰撞電壓為35 V，毛細管電壓為4 500 V（負離子）和5 500 V（正離子），離子源溫度為400 ℃（負離子）和550 ℃（正離子），去簇電壓為60 V。氣簾氣流量為25 L/min，Gas1和Gas2氣流量均為50 L/min，氣體均為氮氣。

表1 梯度洗脫程序信息Table 1 Gradient elution program information

1.3.3 數據分析 基于質譜數據庫，通過供試品中一級質譜的準分子離子峰的比對，以及二級質譜數據的解析，對復方供試品中的化學成分進行鑒定，通過對照品對鑒定的化學成分進一步確定。采用Peakview 2.2軟件采集和處理數據，將主要色譜峰的精確相對分子質量與自建的化學成分信息庫進行比對，推測各化合物的分子式，結合對照品質譜碎片信息對色譜峰進行指認和歸屬。

1.4 網絡藥理學的分析方法

1.4.1 數據庫與軟件 使用的網絡數據庫或軟件主要包括中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[14]，PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[15]，SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）[16]，GeneCards? Version 5.0：The Human Gene Database（https://www.genecards.org/）[17]，OMIM?-Online Mendelian Inheritance in Man?（https://www.omim.org/）[18]，DisGeNET Database（http://www.disgenet.org/web/DisGeNE）[19]，Uniprot Database（http://www.uniprot.org/）[20]，Metascape（https://metascape.org/gp/index.html），pharmGKB Database（https://www.pharmgkb.org/），STRING 11.0（https://string-db.org/），Venny 2.1在 線 軟 件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），NCBI GEO（Gene Expression Omnibus，GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），Cytoscape 3.5.1軟件等。

1.4.2 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析壯腰通絡方化學成分及靶點預測 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析獲得壯腰通絡方化學成分，并結合文獻及數據庫最終確認。隨后逐一查詢化合物的SMILE結構，在SwissTargetPrediction數據庫通過配體結構預測成分作用靶點，與TCMSP中收集的化合物的靶點進行對照，最終確定藥物潛在靶點全稱，隨后通過Uniprot數據庫對靶點蛋白名稱進行標準化，選擇物種為“Homo Sapiens”，獲得唯一的Unipot ID號，去除重復后即得到每個藥物及成分的潛在作用靶點。

1.4.3 LIDD疾病靶點獲取 LIDD疾病靶點的收集來源于GeneCards?數據庫、DisGeNET數據庫、OMIM?數據庫、pharmGKB數據庫、NCBI GEO數據庫，通過這些數據庫收集挖掘疾病靶點并進行標準化處理，獲得唯一的Unipot ID號，即得到LIDD疾病靶點。

1.4.4 壯腰通絡方治療LIDD的網絡構建及關鍵靶點獲取 在獲得藥物成分及其靶點后，通過Cytoscape 3.5.1軟件構建中藥—活性成分—藥物靶點的可視化網絡圖。同時，通過軟件將中藥預測的靶點與疾病的靶點進行映射，獲得壯腰通絡方治療LIDD的交集靶點。

1.4.5 靶點蛋白與蛋白互作網絡分析（protein-protein interaction analysis，PPI） 將獲得的共有靶點上傳至在線STRING 11.0數據庫，選擇類型為“Homo Sapiens”，設置參數評分值>0.4，其他參數為默認設置，同時去掉PPI網絡中的孤立蛋白，導出PPI分析結果，并提取其網絡中的核心靶點蛋白。

1.4.6 靶點基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 通路富集分析通過Metascape在線軟件中Geneenrichment富集分析對獲取關鍵靶點的生物學過程進行分析，主要包括生物過程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）、細胞成分（cellularcomponent，CC）三個類別，獲得富集分析的結果（P<0.05）。然后通過Cytoscape 3.5.1軟件中的“ClueGO”插件對獲得的關鍵靶點進行KEGG信號通路富集分析，獲得顯著富集的信號通路（P<0.05）。

2 結果

2.1 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術的壯腰通絡方化學成分 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對復方供試液及對照品溶液進行了正離子、負離子全掃描，獲得正、負離子模式下的總離子色譜圖，見圖1。根據色譜信息（色譜峰保留時間、紫外吸收特征等）和質譜信息（精確相對分子質量、二級質譜裂解碎片等）與對照品比對，并結合文獻分析，共鑒定出壯腰通絡方中129種化學成分，其中正離子模式下獲得98種，負離子模式下獲得31種?；瘜W成分包括丹酚酸A、丹酚酸B、阿魏酸、芥子酸、大黃酚等多種酚酸類化合物，丹參酮ⅡA、去氫丹參酮ⅡA、異丹參酮Ⅱ等多種醌類化合物，洋川芎內酯K、洋川芎內酯N等多種苯酞內酯類化合物，具體見表2。

圖1 壯腰通絡方總離子流Figure 1 Total ion flow of Zhuangyaotongluo decoction

表2 壯腰通絡復方化學成分鑒定結果Table 2 Chemical constituents identified in Zhuangyaotongluo decoction

（續表2）

（續表2）

（續表2）

2.2 LIDD疾病靶點獲取 通過GeneCards?數據庫、DisGeNET數據庫、OMIM?數據庫、pharmGKB數據庫、NCBI GEO數據庫分別獲得LIDD疾病靶點1 123個、2個、5個、5個、1 868個，經過標準化去重后獲得2 873個，即為LIDD相關疾病靶點。

2.3 壯腰通絡方—活性成分—藥物靶點網絡構建及疾病靶點與藥物靶點映射 通過Cytoscape 3.5.1軟件構建基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析的壯腰通絡方—活性成分—藥物靶點的可視化網絡圖，經過篩選共獲得壯腰通絡方中9味藥物包含的129種化學成分，其對應的藥物成分靶點共203個，見圖2；通過軟件對LIDD疾病靶點與藥物靶點進行映射，獲得96個壯腰通絡方治療LIDD的作用靶點，見圖3。

圖2 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析的壯腰通絡方—活性成分—藥物靶點可視化圖Figure 2 Visualization of Zhuangyaotongluo decoction—active ingredients—action targets based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

圖3 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術的壯腰通絡方活性成分靶點——疾病靶點韋恩圖Figure 3 Venn diagram of active ingredient targets of Zhuangyaotongluo decoction based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

2.4 PPI網絡分析 將獲得的96個交集靶點上傳至STRING 11.0在線數據庫形成PPI互作網絡，獲得相應的相互作用信息，見圖4，并根據Count值提取了網絡中的關鍵靶點蛋白，主要包括絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、胰島素蛋白（INS）、白介素6（IL-6）、原癌基因蛋白（FOS）、胱天蛋白酶3（CASP3）等，列舉了排名前30的關鍵蛋白，見圖5。

圖4 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析的壯腰通絡方治療LIDD的PPIFigure 4 PPI network of Zhuangyaotongluo decoction for LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

圖5 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析的壯腰通絡方治療LIDD的PPI關鍵靶點（排名前30）Figure 5 The key targets of PPI network of Zhuangyaotongluo decoction in the treatment of LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis（top 30）

2.5 GO生物功能注釋 通過Metascape在線軟件對關鍵靶點的生物學過程進行了分析，共確定了1 022條BP信息，主要包括平滑肌的適應性、對發熱的積極調節、發熱的調節、前列腺增生、發熱生成等；28條CC信息，主要包括過氧物酶體、微生物、細胞膜上的膜筏、膜微域、膜區等；51條MF信息，主要包括一氧化二氮合成酶調節器的活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄輔助因子的結合、轉錄輔激活劑結合、核受體活動、轉錄因子活性、直接配體調節序列特異性DNA結合等。見圖6。

圖6 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析的壯腰通絡方治療LIDD的GO富集分析（排名前10）Figure 6 GO enrichment analysis of Zhuangyaotongluo decoction for LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis in terms of information regarding biological process，cellular components and molecular function（top 10）

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析共確定了98條相關信號通路，其條目中主要包括的信號通路為：HIF-1 signaling pathway，JAK-STAT signaling pathway，Relaxin signaling pathway，p53 signaling pathway，MAPK signaling pathway，Fc epsilon RI signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，TNF signaling pathway，AMPK signaling pathway等（P<0.05）。見圖7。

圖7 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析的壯腰通絡方治療LIDD的KEGG通路富集分析Figure 7 KEGG analysis of signaling pathways of Zhuangyaotongluo decoction for LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

3 討論

中藥復方的化學成分十分復雜，具有多成分、多靶點、多途徑協同作用的特點，因此，在臨床療效確切的基礎上，解析復方藥效物質基礎及闡明其作用機制一直是中醫藥研究的重點與難點，也是促進中藥新藥研發及推動中醫藥現代化和國際化面臨的艱巨挑戰[21-22]。近年來，越來越多的學者將UPLC-Q/TOF-MS/MS技術與網絡藥理學方法有機結合起來，尤其在中醫藥研究領域中更為顯著[23-24]。UPLC-Q/TOF-MS/MS技術的應用，為全面、精準、快速地闡明復方及其包含的化學成分提供了強有力的保障。LI等[25]對高效液相色譜/質譜聯用技術在中藥成分分析、代謝物分析、藥動學等方面的應用進行了綜述，發現其中50%的文獻涉及中藥化學成分分析，表明該領域目前研究最多。而以網絡化、系統化為特征的網絡藥理學研究與中醫藥整體觀念不謀而合，其廣泛應用于包括中藥靶點預測、活性化合物篩選、中藥方劑網絡調控機制等中醫藥領域研究中，在探索復雜生物學過程中發揮著至關重要的作用[26-27]。

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS/MS技術與網絡藥理學相結合的方法，分析臨床有效方劑壯腰通絡方的化學成分并探討其延緩LIDD的作用機制。研究發現，壯腰通絡方具有多種藥物包含同一個成分，不同成分存在相同靶點及多靶點、多途徑作用特點。在質譜技術分析獲得的129個化學成分中，如果按照口服生物利用度≥30%、類藥性指數≥0.18的標準進行篩選，符合要求的化學成分僅38個。因此，既往的網絡藥理學分析僅依靠這兩個參數的篩選，是否會因為篩選參數閾值過高而將可能發揮藥效作用的化學成分過濾掉，這些化學成分是否均能順利進入胃腸道吸收或者成為入血成分，仍有待于進一步深入研究。另外，在本研究分析獲得的有效成分中，桃葉珊瑚苷、丹酚酸B等化學成分已通過實驗證實能夠有效延緩椎間盤退變，其與炎癥抑制、免疫調節等作用機制密切相關[28-29]，壯腰通絡方中的其他化學成分也包含抗炎、止痛、抗細胞凋亡、抗氧化應激、延緩衰老等藥理功效[30-31]。這些均可以作為今后體內外干預試驗中重點關注的化學成分。

從PPI蛋白相互作用關系的結果來看，關鍵靶點AKT1是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶蛋白，能夠調控細胞的增殖和分化，參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的生物學過程，其參與介導的相關信號通路在椎間盤退變中發揮重要作用[32]。IL-6作為IL家族中最重要的炎性細胞因子，是椎間盤退變過程中炎癥發生和參與的重要遞質，值得在研究中密切關注[33]。從GO富集分析和KEGG通路富集分析來看，涉及的生物學過程主要包括對miRNA基因沉默中涉及的miRNA產生的負調控，細胞組成主要包括細胞質膜、細胞器膜等；分子功能主要包括RNA聚合酶Ⅱ轉錄輔因子結合、轉錄輔激活劑結合、核受體活性、轉錄因子活性等。KEGG信號通路主要集中在炎癥、血管生成、細胞凋亡、轉化因子等相關信號通路。WU等[34]采用HIF-1alpha敲除小鼠模型證實缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）通過HIF-1α/血管內皮生長因子（VEGF）信號通路對髓核細胞存活和細胞外基質內環境調節起關鍵作用，在椎間盤退變的發生、發展中起重要作用。CHEN等[35]采用人和大鼠中的髓核組織標本證明了IL-21參與了椎間盤退變的病理過程，其可通過STAT信號通路刺激TNF-α，從而加重椎間盤退變。Janus激酶（JAK）/轉導和轉錄激活因子（STAT）信號通路是一條由細胞因子刺激的信號轉導通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡及免疫調節等許多重要的生物學過程?？傊?，壯腰通絡方可能是通過介導這些關鍵信號通路來發揮治療作用的，有待于未來進一步結合關鍵靶點進行體內外試驗驗證。

綜上所述，本研究通過UPLC-Q-TOF-MS/MS技術初步闡明了壯腰通絡方中包含的化學成分，并結合網絡藥理學方法從多個角度探索了其延緩LIDD的潛在分子機制，明確了其藥效關鍵靶點及信號通路，為該方進一步的藥效物質基礎和作用機制研究提供了參考依據。

作者貢獻：孫凱負責文章撰寫與修改；秦曉寬、楊博文進行實驗操作及制圖；銀河、李秋月指導實驗操作，負責數據核對；朱立國、魏戌負責研究的設計與可行性分析，對文章進行質量把控及審校，整體負責。

本文無利益沖突。