柴胡皂苷a通過影響PPARα信號通路對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脂肪變的保護作用*

顧雪香，李祥玉，單勤星

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指排除酒精、藥物、免疫損傷、病毒感染等明確損肝因素以外，發生超過5%肝細胞脂肪變性引起的疾病。研究發現[1，2]，胰島素抵抗(IR)在NAFLD發病中具有重要的作用，不僅可阻礙胰島素對脂肪的代謝，增加機體脂肪量，而且會導致高胰島素血癥，使血液游離脂肪酸(FFA)增多，脂蛋白合成減少，堆積于肝臟。因此，積極改善IR為治療NAFLD提供了新的思路。柴胡是祖國醫學常用的中藥，其中藥方劑除作為護肝藥物廣泛應用于急性肝損傷和肝纖維化等的治療外，近年來也作為改善IR藥物逐漸應用于治療糖尿病患者[3-5]。柴胡皂苷a(saikosaponin a，SSa)是柴胡的主要有效成分，其抗病毒、抗炎、抗腫瘤等藥理作用已被廣為認可，但關于其改善IR作用及其應用于治療NAFLD效果的研究尚少。本研究通過建立NAFLD大鼠模型，并給予SSa干預，觀察了對脂肪變的干預效果，并探討了其可能的作用機制，為SSa應用于臨床提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器、藥品、試劑 46只SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質量為190～210 g，由上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部提供[動物許可證號為SCXK(滬)2018-0006]。URIT-8020A全自動生化分析儀(桂林優利特電子集團有限公司)、Synergy-HD顯微鏡(日本Toshiba公司)、Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳儀(美國伯樂公司)。SSa(純度>98%，上海博麥德生物技術有限公司)、抗過氧化物增殖物活化受體α(PPARα)信號通路抑制劑GW6471(美國R&D Systems公司)、高脂飼料(江蘇省協同醫藥生物工程有限公司)、血糖測定試劑盒、放射免疫分析測定胰島素試劑盒(北京北方生物技術研究所有限公司)，檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、FFA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，油紅O染色試劑盒(上海懋康生物科技有限公司)，兔抗大鼠5-單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase， AMPK)、抗p-AMPK、抗過氧化物增殖物活化受體α(peroxide proliferator activated receptor α，PPARα，美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 NAFLD模型建立[6]隨機將46只大鼠分為對照組10只和NAFLD組12只、SSa干預組12只和SSa聯合GW6471干預組12只。給予對照組動物普通飼料喂養，給予其他組動物高脂飼料(普通飼料73%、豬油20%、白糖4%、奶粉2%、膽固醇1%)喂養8 w。在干預組，每組取2只動物檢查造模情況。在建模成功后，分別給予SSa 5 mg.kg-1(溶于生理鹽水)灌胃，或SSa灌胃和GW6471 3.5 mg.kg-1腹腔注射，或給予等體積生理鹽水灌胃和腹腔注射，1次/d，連續干預14 d。在末次給藥后禁食不禁水24 h，稱體質量。給予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經腹主動脈取血5 mL。采用脫頸法處死大鼠，冰盤上分離肝臟，稱質量，計算肝指數(%)=肝臟質量/體質量×100%；將其余肝組織置于液氮中保存。

1.3 血糖指標檢測 采用葡萄糖氧化酶偶聯比色法和放射免疫分析法檢測空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)，計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.4 肝組織脂肪含量檢測 取出液氮保存的肝組織，按照肝組織質量：生理鹽水=1:9勻漿，4 ℃搖床過夜，離心10 min，收集上清，使用全自動生化分析儀檢測TC、TG和FFA含量。

1.5 肝組織病理學檢查 取肝組織，低溫速凍后，切成7 μm厚的切片，常溫風干0.5 h，4%多聚甲醛固定10 min，蒸餾水充分沖洗。在60%異丙醇中浸泡180 s。導入油紅O儲液60 mL、蒸餾水40 mL 30min。加60%異丙醇，蒸餾水充分沖洗，蘇木精對比染色120 s，蒸餾水充分沖洗，用水性封片機固封，常溫陰干后在顯微鏡下觀察。

1.6 肝組織AMPK、p-AMPK和PPARα蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測，取液氮保存的肝組織，研磨后轉至離心管，加入RIPA裂解液裂解30 min，用BCA試劑盒定量。取60 μg樣品，按比例與上樣緩沖液混合，100 ℃金屬浴煮5 min，使蛋白變性，在8%凝膠上電泳分離蛋白質，濕轉至膜，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗大鼠AMPK(1:400)、抗p-AMPK(1:400)、抗PPARα(1:500)、抗GAPDH，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔IgG(1:2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌，加入ELC顯影劑于暗室曝光、顯影，在凝膠成像系統掃描分析，以AMPK、p-AMPK、PPARα灰度值/內參GAPDH灰度值表示蛋白相對表達量，計算p-AMPK/AMPK比值。

2 結果

2.1 各組血糖指標比較 與對照組比，NAFLD組FBG、FINS和HOMA-IR顯著升高(P<0.05)；與NAFLD組比，SSa干預組FBG、FINS和HOMA-IR顯著降低(P<0.05)；與SSa干預組比，SSa聯合GW6471干預組FBG、FINS和HOMA-IR顯著升高(P<0.05，表1)。

表1 各組血糖指標比較

2.2 大鼠肝指數和肝組織脂質含量比較 與對照組比，NAFLD組肝指數和肝組織TC、TG、FFA含量顯著升高(P<0.05)；與NAFLD組比，SSa組肝指數和肝組織TC、TG、FFA含量顯著降低(P<0.05)；與SSa組比，SSa聯合GW6471組肝指數和肝組織TC、TG、FFA含量顯著升高(P<0.05，表2)。

表2 各組肝指數和肝組織脂質含量比較

2.3 各組肝組織病理學表現比較 NAFLD組可觀察到橘紅色脂滴呈彌漫性分布和大泡性脂肪變，而在SSa干預組和SSa聯合GW6471干預組肝組織脂滴顯著減少，其中SSa組脂滴少于SSa聯合GW6471組(圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織脂質沉積表現(油紅O染色， 200×)A：對照組；B：NAFLD組；C：SSa組；D：SSa聯合GW6471組

2.4 各組肝組織PPARα蛋白相對表達量比較 與對照組比，NAFLD組PPARα蛋白相對表達量和p-AMPK/AMPK比值顯著降低(P<0.05)；與NAFLD組比，SSa干預組PPARα蛋白相對表達量和p-AMPK/AMPK比值顯著升高(P<0.05)；與SSa干預組比，SSa聯合GW6471干預組PPARα蛋白相對表達量和p-AMPK/AMPK比值顯著降低(P<0.05，表3)。

表3 各組肝組織蛋白相對表達量比較

3 討論

本研究結果顯示，采用SSa干預NAFLD大鼠后，其FBG、FINS、HOMA-IR、肝指數，肝臟組織TC、TG、FFA含量均顯著降低，肝組織脂滴減少，提示SSa可有效改善NAFLD大鼠IR，并減少肝組織脂質沉積。SSa是柴胡提取物中活性最強的成分之一，有抗內毒素、調節免疫系統功能、抗炎、抗腫瘤、保肝、護腎等廣泛的藥理作用，但目前關于其調節糖脂代謝作用的研究尚少。有學者在治療血糖不能控制的2型糖尿病時發現[7-9]，柴胡桂枝干姜湯方可有效控制血糖，促進胰島素分泌并抑制IR，在此方中柴胡可能發揮了功效。此外，現代藥理學研究表明[10-12]，SSa可調節肝細胞能量代謝異常、維持鈣平衡、抑制脂質和氧自由基過氧化、調節肝細胞免疫功能，阻滯纖維化進程，從而發揮肝細胞保護作用，說明其具有調節糖脂代謝平衡的生物學功能。

PPARα屬于新型甾體類激素受體，通常表達于肌肉組織和進行FFA氧化的器官。研究發現[13-16]，PPARα激活后可促進肝組織FFA發生β氧化，調控脂質代謝基因表達，提高脂質利用效率，減少FFA合成和在肝臟的沉積。AMPK通過感受胞漿AMP與ATP的比值變化調節細胞物質代謝，調控骨骼肌對葡萄糖的攝取、FFA氧化和ATP生成，以維持細胞能量的平衡[17-19]。研究表明[20]，抑制AMPK磷酸化，PPARα表達明顯下調，能加快NAFLD進程，而激活AMPK則具有胰島素增敏效應，促進脂肪酸氧化代謝。由此可推測，AMPK-PPARα信號通路可能是治療NAFLD的新靶點。