慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞Galectin-3基因水平對聚乙二醇干擾素α治療應答的影響*

許政衡，黃 勇，柯海霞，李 南，馬乙云

流行病學調查顯示，全球約20億人曾感染過乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，目前仍有2.5億HBV攜帶者[1]。乙型肝炎慢性化的機制尚未完全明確，相關診治指南建議應用聚乙二醇干擾素-α或長期給予核苷(酸)類似物治療慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)。相對于核苷(酸)類似物，聚乙二醇干擾素-α治療CHB患者具有HBeAg血清學轉換率高、停藥復發率低、不易產生耐藥性和病毒變異低等優勢，但部分患者經α-干擾素治療仍不應答[2,3]。治療CHB的最終目標是最大限度地抑制HBV復制。半乳糖凝集素-3(galectin-3)參與機體細胞的黏附和凋亡、促進單核細胞向巨噬細胞分化、新生血管的形成等多種生物學活動，在維持HBV復制和促成HBV感染的活動中發揮重要的作用，與HBV感染的慢性化密切相關[4,5]。有研究[6]表明，血清Galectin-3水平與CHB和慢性丙型肝炎患者預后有關，可為疾病的臨床治療提供參考。免疫功能紊亂是CHB發病的重要病因之一，外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)參與機體的免疫功能，了解PBMCs的功能狀態對指導治療CHB患者具有重要的意義[7]。本研究檢測了CHB患者PBMCs galectin-3水平及其α-干擾素治療應答的影響，為臨床治療CHB患者提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2016年12月～2019年12月我院收治的CHB患者106例，男性62例，女性44例；年齡為26～61歲，平均年齡為(42.6±7.3)歲。符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]診斷標準，納入標準：(1)未接受過免疫調節劑和抗病毒治療；(2)無精神類疾病，依從性較好，能夠配合研究，連續使用聚乙二醇干擾素α-2a治療48周。排除標準：(1)合并其他類型肝炎；(2)合并自身免疫性、遺傳性肝病或藥物性肝損傷；(3)合并嚴重的心肺功能損傷；(4)妊娠期或哺乳期女性。另選擇同期健康體檢者25例作為對照組，男17例，女8例；年齡為24～58歲，平均年齡為(41.7±6.8)歲。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 治療方法 給予所有患者聚乙二醇干擾素α-2a(上海羅氏制藥有限公司，國藥準字J20070055)180 μg皮下注射，1次/w，連續治療48 w。

1.3 療效評價標準 參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]標準評估療效，血清轉氨酶水平降至正常范圍，血清HBV DNA水平陰轉，血清HBeAg陽性患者發生或不發生血清HBeAg陰轉，即為應答者，否則視為未應答。

1.4 PBMCs中galectin-3 mRNA檢測 清晨空腹抽取靜脈血10 mL，加入EDTA抗凝管，置于-70℃冰箱保存待檢。取靜脈血1 ml，與等量磷酸緩沖鹽溶液混勻，加入Ficoll淋巴細胞分離液(中國科學院天津試劑廠)3 ml，離心，使用無菌一次性滴管小心吸取Ficoll分離液與血漿交界處的灰白色層(PBMCs)，加入EP管中再次離心，棄去上清，即獲得白色細胞團(PBMCs)。采用Trizol法提取PBMCs全基因組RNA，再使用逆轉錄試劑盒(FINNZYMES公司)逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增，擴增引物由上海生工生物公司合成，Galectin-3正、反向引物序列分別為 5’-GCGGAAATGGCACAATT-3’和5’-CTTGAGGGTTTGGGTTTCCA-3’，PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳加以驗證，計算Galectin-3基因相對水平，采用2-△△Ct表示。

1.5 PBMCs中galectin-3蛋白檢測 采用Westem blot法檢測，取外周血，以RIPA裂解液裂解，離心后取上清液，以BCA法測定蛋白濃度。取PBMCs總蛋白，電泳分離，經硝酸纖維素膜轉移，0.1%麗春紅染色，使用適量的TBST緩沖鹽溶液在轉移脫色床上洗膜3次，每次15 min，再以含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，加入第一抗體(美國Millipore公司)，室溫震蕩孵育1 h，再與第二抗體(美國Millipore公司)結合，作用1 h，以二氨基聯苯胺(DAB)顯色法進行顯色并攝像。

1.6 血清檢測 使用美國貝克曼庫爾特公司生產的AU5800全自動生化分析儀檢測血生化指標；采用實時熒光定量PCR法檢測血清HBV DNA水平(上海恪敏生物)。

2 結果

2.1 療效情況 在治療24 w，本組CHB患者應答27例(22.6%)；在治療48 w，應答44例(67.0%)。

2.2 不同應答患者血生化和HBV DNA 水平比較 在入組時，不同應答組血清AST、ALT、TBIL和HBV DNA水平無顯著性差異(P>0.05，表1)。

表1 不同應答組血生化和HBV DNA 水平比較

2.3 不同應答組PBMCs galectin-3基因及其蛋白表達水平比較 24 w應答患者PBMCs galectin-3基因及其蛋白表達水平顯著高于48 w應答、不應答或健康人(P<0.05)；48 w應答患者PBMCs galectin-3 mRNA水平顯著高于不應答組或健康人(P<0.05，表2)。

表2 不同應答組PBMCs Galectin-3 mRNA及其蛋白表達比較

3 討論

聚乙二醇干擾素-α為常用的抗病毒治療的一線藥物，其治療療效可能會受到病毒基因型和宿主等因素的影響。目前，仍存在部分患者經聚乙二醇干擾素-α治療并不產生應答或不能獲得完全應答，原因尚不明確[9]。CHB發病機制可能涉及Treg細胞與效應T細胞之間的免疫失衡，并與HBV感染慢性化有關。細胞免疫應答的活力和強度可以決定HBV感染是否是被清除或是持續，免疫應答的減弱可能導致HBV很難被免疫系統清除，使HBV感染慢性化，轉變為持續感染。因此，機體免疫狀態對α-干擾素治療CHB患者的結局具有重要的影響[10,11]。

Galectin-3是半乳糖凝集素家族的重要成員之一，廣泛存在于細胞質、細胞膜和細胞外基質中，其生物學功能復雜，參與調控細胞黏附、遷移、增殖、凋亡和炎癥反應等過程[12]。既往臨床對于galectin-3的研究主要集中于參與癌癥發生機制方面，結果表明galectin-3可與相應配體結合影響細胞的生長、凋亡、分化和新生血管形成等過程，且可能成為癌癥治療的潛在靶點[13]。在肝癌方面的研究[14]表明，galectin-3表達后細胞增殖能力下降，并提示肝損傷的存在，影響患者的治療預后。還有針對肝癌和CHB患者的相關血清學研究[15]發現，galectin-3是鑒定HBV相關肝癌的潛在生物標志物，能夠提高臨床診斷的效能，表明galectin-3在肝臟疾病的發生、發展和治療預后方面發揮著重要的作用，而位于細胞內的galectin-3具有抑制細胞凋亡作用，其抑制細胞凋亡作用可能影響HBV復制和HBV感染過程，從而對臨床肝臟疾病治療產生影響[16]。此外，galectin-3還被證實與肝細胞再生有關，且極有可能是通過激活調節肝細胞再生過程中的信號通路Wnt/β-catenin 通路實現對肝細胞再生的調節，從而對肝臟疾病的治療產生影響[17,18]。PBMC主要包含淋巴細胞和單核細胞，是固有免疫和適應性免疫應答的共同參與者。PBMCs表達的相關因子與機體免疫應答的啟動有關。galectin-3基因表達能夠促進單核細胞向巨噬細胞分化，在肝臟組織，PBMCs發揮抗原遞呈作用，激活體內免疫應答系統，對HBV的復制發揮抑制作用，實現抗病毒功能[19,20]，而galectin-3表達對機體清除HBV的影響可能會對治療CHB患者的療效產生影響，但目前關于這方面的臨床研究仍較少。基于此，本研究分析了CHB患者外周血單個核細胞galectin-3表達對α-干擾素治療應答情況的影響，結果顯示，本組治療24 w應答率為22.6%，治療48 w應答率為67.0%。應用聚乙二醇干擾素-α治療CHB患者仍存在部分患者不產生應答或不能獲得完全應答的現象。分析不同應答情況患者外周血單個核細胞galectin-3表達情況發現，在治療24 w時，應答組患者外周血單個核細胞galectin-3基因及其蛋白表達水平相對于此時未應答的、在治療48 w時才應答組和始終未應答組患者均顯著升高，而在治療48 w時，應答組患者外周血單個核細胞galectin-3基因及其蛋白表達水平也顯著高于不應答患者。在聚乙二醇干擾素-α治療CHB患者過程中，應答者機體外周血單個核細胞galectin-3基因及其蛋白均呈高表達，高表達的galectin-3基因及其蛋白在機體發揮抗病毒作用過程中可能起了關鍵作用，進一步表明聚乙二醇干擾素-α可能通過上調galectin-3基因及其蛋白表達發揮抗病毒作用的，但具體作用機制尚需進一步研究。

綜上所述，CHB患者外周血單個核細胞galectin-3基因及其蛋白表達水平與聚乙二醇干擾素α治療療效密切相關。galectin-3基因及其蛋白均高表達提示患者對治療應答，但本研究分析galectin-3基因及其蛋白表達情況應用的數據為相對表達量，且觀察時間點較少，在后續研究應考慮采取多點采樣檢測以獲取更為準確地galectin-3基因及其蛋白表達水平資料，動態分析galectin-3基因及其蛋白表達在CHB患者接受α-干擾素治療過程中的變化。另外，我們并不知道肝組織galectin-3基因及其蛋白表達變化的規律，它們與肝組織炎癥、纖維化和病毒載量的關系等，都需要認真研究。在α-干擾素治療過程中，可觀察的項目比較多，如何整合有價值的指標，聯合檢測，可能對更好地預測抗病毒治療的效果有幫助。深入分析α-干擾素通過調節galectin-3基因及其蛋白表達發揮抗病毒作用的具體機制也很有必要。