原發性膽汁性肝硬化患者外周血絲氨酸蛋白酶抑制劑A1基因多態性分析*

吳曉楓，黃 怡，楊如杏，鄧少東，張靜瑩，官成濃，王 穎

原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種多見于中老年女性的慢性肝內膽汁淤積性疾病，在北美和北歐國家發病率相對較高[1，2]。PBC患者臨床表現主要有乏力、皮膚瘙癢等，自然發病史包括臨床前期、無癥狀期、癥狀期和失代償期。由于該病在發病前進展較為緩慢，可長達10～15年，通過檢測可靠的生物標志物對該病進行早期篩查具有重要的臨床意義[3，4]。既往研究[5，6]發現，基因遺傳多態性可能是個體間PBC易感性差異的重要原因，已有多個基因被報道與不同人種PBC易感性有關。絲氨酸蛋白酶抑制劑A1基因(serine protease inhibitor A1，SERPINA1)是α1-抗胰蛋白酶家族(α1-antitrypsin family，AAT)的重要成員[7]，已有國外學者報道SERPINA1 基因多態性與PBC易感性存在關聯，但有關結論還存在不一致性[8，9]。本研究檢測了62例PBC患者外周血SERPINA1基因多態性，旨在為該病的臨床診治和發病機制研究提供有價值的資料，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2018年3月～2020年3月在我院就診的PBC患者62例，診斷符合《原發性膽汁性肝硬化診斷和治療共識(2015年)》的標準[10]，排除標準：①患有病毒性肝炎或藥物性肝損傷；②患有嚴重的心、腦、血液系統疾病和感染性疾病；③入院前接受過相關藥物治療；④有精神狀態異常。另選擇同期在我院體檢的健康人群60例作為對照組，所有納入對象均對本研究知情同意，研究經我院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 外周血基因提取和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點基因分型檢測 抽取外周血3 mL，采用酚-氯仿法提取DNA，使用NanoDrop公司提供的NanoDrop2000超微量分光光度計檢測DNA濃度和純度，將合格標本保存于-20℃冰箱備用。針對SERPINA1 基因rs28929474位點設計特異性引物，上游引物rs28929474-F：5′-TCCAGGCCGTGCATAAGG-3′，下游引物rs28929474-F：5′-GCCCCAGCAGCTTCAG-3′，引物交由南京擎科生物技術有限公司合成。PCR反應體系為20μL：DNA模板1μL，PCR反應液10μL，上、下游引物各1μL，雙蒸水7μL。PCR反應條件：94℃預變性4 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 42 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min。取PCR產物，經1.8%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行確認。取10μL擴增產物進行純化，將純化后的產物送南京擎科生物技術有限公司測序，對SERPINA1 基因rs28929474位點基因型和等位基因進行分析和記錄。

1.3 血清自身抗體檢測 使用YHLO公司生產的自身免疫性肝病抗體譜檢測試劑盒(免疫印跡法) 檢測血清自身抗體；采用歐蒙公司生產的檢測抗線粒體抗體譜( anti-mitochondrial antibody，AMA) 試劑盒(歐蒙斑點法)。

2 結果

2.1 兩組一般資料 兩組性別、年齡、BMI差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組SERPINA1基因rs28929474位點基因型和等位基因頻率比較 兩組人群外周血SERPINA1 基因rs28929474位點基因型分布符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)，具有群體代表性。PBC患者與健康人基因型分布頻率存在顯著性差異(P>0.05)；PBC患者AA基因型和A等位基因頻率顯著高于對照組(P>0.05)，而GG、GA基因型和G等位基因顯著低于對照組(P>0.05，表2)，提示A等位基因是患者發生PBC的保護性因素，而G等位基因可能是患者發生PBC的風險因素。

表2 兩組SERPINA1 基因rs28929474位點基因型和等位基因頻率(%)分布比較

2.3 不同基因型PBC患者Child評分和MELD評分比較 攜帶GA/AA型PBC患者Child評分和MELD評分顯著高于GG型PBC患者(P>0.05)，兩組血清抗核抗體(ANA)和AMA-M2抗體陽性率比較無顯著性統計學差異(P>0.05，表3)。

表3 不同基因型PBC患者肝功能評分和血清自身抗體陽性率比較

3 討論

PBC患者肝組織病理學表現主要有進行性、非化膿性、破壞性肝內小膽管炎、伴門管區淋巴細胞浸潤和肝纖維化等。近年來，隨著AMA檢查的逐漸普及，PBC的確診率有了明顯的提升[11]。研究發現，PBC患者住院期間發生醫院感染風險顯著增加，較普通人可增加5倍以上，除自發性細菌性腹膜炎外，還可引發尿路感染、肺部感染和血流感染，這些合并癥可進一步導致病情的進展，導致患者出現肝衰竭，甚至死亡，是患者不良預后的重要原因。PBC可伴發皮膚、關節和腺體的自身免疫性疾病，如硬皮病、干燥綜合征等，在臨床上受到實驗室條件、臨床醫生對疾病認知不足等因素的限制，導致該病常被誤診為病毒性肝炎、肝炎肝硬化或結締組織病，不但延誤了治療時機，還增加了治療負擔和經濟成本，影響患者預后。目前，已有C反應蛋白(C reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)等可供檢測，但由于PBC患者長期處于全身性慢性炎癥狀態，這些血液學指標的判斷效能不足，篩選出可靠的血液生物標志物對該病進行提前診斷和治療具有重要的意義[12，13]。

研究[14]發現PBC發病存在一定的家族聚集性和性別差異，女性患病率明顯升高，說明PBC是一種受到個體間遺傳多態性影響的疾病。已有研究發現漢族人群PBC發病與CD58基因、CD28基因、CD80基因、STAT4基因、IL-21基因、IL-12A基因等存在關聯[15-19]。絲氨酸蛋白酶家族蛋白分子量大小約為40～50 kD，主要通過影響基質金屬蛋白酶(MMPs)活性參與細胞外基質的水解過程，對機體炎癥反應、細胞遷移、纖維蛋白溶解、細胞凋亡等生理過程產生重要的影響[20，21]。SERPINAI是一種高度保守的急性期時相反應蛋白，主要在肝臟合成和分泌，在其他組織細胞如腸上皮細胞、單核細胞和腫瘤細胞也產生[22]。在高級別腦膠質瘤組織SERPINA蛋白表達增加，且與患者預后不良有關[23]。在先兆子癇孕婦，尿液SERPINA mRNA水平上調，被認為是評估先兆子癇病情嚴重程度的有潛力的生物標志物[24]。肺氣腫患者SERPINA1基因變異與肺功能改變有關[25]。研究發現[26]，SERPINAI基因rs8004738位點多態性與中國人群慢性阻塞性肺疾病存在關聯。本研究采用基因測序法對本地區PBC患者外周血SERPINA1 基因rs28929474位點多態性進行調查，結果發現該位點主要包含GG、GA、AA基因型，而PBC患者AA基因型、A等位基因頻率顯著高于健康人，經Logistic回歸分析結果也顯示了攜帶G等位基因是攜帶A等位基因型患者發生PBC風險的2.32倍，表明該位點的遺傳多態性與本地區居民PBC易感性存在一定的關聯。

Child評分和MELD評分是臨床評估肝硬化患者肝臟功能的指標，對于PBC患者預后也有一定的預測價值。本研究進一步分析了攜帶不同基因型PBC患者Child評分和MELD評分及ANA、AMA-M2抗體陽性率的差異，結果顯示攜帶GA/AA型PBC患者Child評分和MELD評分更高，但ANA和AMA-M2陽性率無顯著性差異。本研究結果顯示了SERPINA1基因rs28929474位點多態性對于判斷PBC患者病情也有一定的價值，推測其原因可能是：SERPINA1在基因水平上的變異可能改變SERPINA1 蛋白轉錄，進而對肝細胞細胞外基質清除、炎癥反應和細胞凋亡等生物學過程產生影響，導致對PBC的易感性差異[27，28]。SERPINA1 基因可能存在多處多態性位點而對PBC易感性產生影響，其它位點對PBC易感性的影響以及不同位點之間的交互效應有待進一步研究和完善。肝硬化涉及免疫反應發病機制，目前研究尚未明確，臨床上也無有效藥物逆轉肝硬化的進程。因此，在患者疾病發生早期采取有效的干預和管理措施，對相關并發癥進行充分的預防，對于提高患者生存期，改善患者預后具有重要的意義。

綜上所述，本研究結果證明了本地區居民發生PBC可能與SERPINA1 基因rs28929474位點多態性有關，其中A基因可能是保護基因，而G基因可能是風險基因。監測外周血SERPINA1 基因rs28929474位點多態性對于預測PBC的發生可能具有一定的臨床意義。