甘草地上部分指標性成分的確認及含量測定研究△

馮鑫，杜裕，邵會涵，劉益江，于冰莉，方永晟，侯俊玲，2，王文全，2，3，劉永剛*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；2.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京 100102；3.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

甘草地上部分約占整株的1/3，生物量占比較大[1]，但目前多以燃料或者畜牧飼料的方式對其進行處理，造成了較大的資源浪費。經研究，甘草地上部分中黃酮類成分含量高[2-4]，并有較好的藥理活性。在我國的新疆地區，很早就有以甘草葉泡茶飲用來預防和治療前列腺炎的傳統，也得到了相關實驗的證實[5-7]，推測甘草葉水提物中的黃酮類物質發揮了主要作用[7]。此外，甘草地上部分還具有一定的抗糖尿病作用[1]。有研究者對甘草地上部分的安全性也進行了初步評價，急性毒性分級屬無毒級，相當于成年人的日致死劑量>500 g[8]。

本課題組以烏拉爾甘草地上部分為研究對象，對其進行提取分離，得到并且鑒定了15 個單體化合物，包括蘆丁、刺甘草查耳酮、喬松素等，其中多為黃酮類成分，而關于甘草地上部分中指標性成分含量測定的研究幾乎為空白。因此，本研究借助網絡藥理學對這15 個單體成分抗前列腺炎的作用進行探究，選取其中重要的單體成分作為指標性成分，建立地上部分含量測定的方法，以期實現甘草地上部分的質量控制。

1 材料

1.1 儀器

島津SPD-M20A 型高效液相色譜儀，光電二極管陣列紫外-可見光檢測器；KH-250 型速控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；BT25S型十萬分之一電子天平、BSA124S-CW 型萬分之一電子天平（賽多利斯公司）。

1.2 試藥

甘草地上部分采自甘肅省酒泉市瓜州縣河東鄉，經中國醫學科學院藥用植物研究所王文全教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的地上部分，編號為S1～S3；對照品蘆丁、刺甘草查耳酮、喬松素均為本課題組自制，通過核磁共振氫譜（1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）、質譜（MS）等手段確證了其結構，高效液相色譜法（HPLC）檢測純度>98%（面積歸一法）；水為娃哈哈飲用純凈水；乙腈、甲酸、甲醇（色譜級，美國Fisher公司）。

2 方法與結果

2.1 基于網絡藥理學分析所得單體成分抗前列腺炎作用

2.1.1 化合物靶點與前列腺炎靶點交集的韋恩分析 通過PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索各化合物英文名，獲得并下載其3D 化學結構。運用SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）得到15 個單體成分（分別為β-谷甾醇、鄰苯二甲酸二丁酯、甘草次酸、刺甘草查耳酮、大豆苷元、木犀草素、山柰酚、對羥基苯甲酸、槲皮素、異甘草素、喬松素、異槲皮苷、水仙苷、蘆丁和短葉松素）可能作用的靶點。通過DigSee（http://210.107.182.61/geneSearch/）和 GeneCards（https://www.genecards.org/）數據庫獲得前列腺炎疾病的作用靶點。

由于檢索到的靶點可能存在命名不規范等問題，運用UniProt（https://www.uniprot.org/）篩選出物種為“人”的靶點，并且將檢索到的蛋白名校正為官方名稱（official symbol），獲得相關靶點信息。利用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲得15 個單體成分作用靶點與前列腺炎疾病相關靶點的交集。

2.1.2 抗前列腺炎交集靶點的相互作用網絡 所得交集靶點上傳至在線STRING 11.5 數據庫（https://string-db.org/），得到交集蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。將PPI 網絡導入Cytoscape 3.7.2 軟件，使用軟件中的“Network Analysis”功能獲得各節點的介度中心性（BC）、接近中心性（CC）和度（degree）。

2.1.3 抗前列腺炎靶點的基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將抗前列腺炎靶點輸入OmicShare（https://www.omicshare.com/）和 DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）平臺，分別進行GO 功能富集分析與KEGG通路富集分析。

2.1.4 結果

2.1.4.1 所得化合物抗前列腺抗炎作用的靶點 運用SwissTargetPrediction數據庫得到15個化合物可能作用的靶點，去重后得到297 個；通過DigSee 和GeneCards 數據庫獲得前列腺炎疾病的作用靶點436 個；利用Venny 2.1 獲得15 個成分抗前列腺炎疾病相關靶點45個（圖1）。

圖1 甘草地上部分成分靶點與前列腺炎交集靶點韋恩圖

2.1.4.2 抗前列腺炎交集靶點的PPI 網絡 將2.1.4.1 項下得到的45 個靶點導入STRING 11.5 數據庫，采用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制PPI 網絡（圖2），并對網絡進行分析。PPI 網絡共有45 個節點、357條邊，平均度為15.9，平均介度中心性為0.017 6，平均接近中心性為0.587 6。其中度值最高的靶點為蛋白激酶B1（Akt1），其次為表皮生長因子受體（EGFR）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、雌激素受體1（ESR1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α（PIK3CA）、前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）、腫瘤壞死因子（TNF）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、MMP-2（均大于平均度、介度中心性、接近中心性），以上所述靶點均可能為抗前列腺炎的關鍵靶點（表1）。核心靶點（前11 個）與成分之間的映射見圖3，可以看出山柰酚、槲皮素、喬松素可能發揮了抗前列腺炎的重要作用。

圖2 甘草地上部分成分靶點與前列腺炎交集靶點PPI網絡

圖3 甘草地上部分成分-核心靶點PPI網絡

表1 甘草地上部分成分抗前列腺炎核心靶點及其拓撲參數

2.1.4.3 抗前列腺炎靶點的GO 功能和KEGG 通路富集分析 依據P<0.001 篩選出GO 條目377 個，其中生物過程（biology process）341 個、分子功能（molecular function）22個、細胞組成（cellular component）14個。如圖4所示，生物過程主要涉及細胞增殖、刺激反應、生物調節過程等；分子功能涉及催化活性、分子功能調節、抗氧化活性等；細胞組成主要涉及細胞器、細胞膜、腔上包膜等。進一步富集發現GO 條目主要聚集在細胞凋亡、增殖、代謝等，反映了這些化合物在抗前列腺炎作用的過程中涉及體內多個生物過程（圖5）。

圖4 甘草地上部分成分抗前列腺炎作用靶點的GO功能分析

圖5 甘草地上部分成分抗前列腺炎作用靶點的GO功能富集

依據P<0.05 篩得抗前列腺炎靶點KEGG 通路76 條，依P值升序排列且在該通路下的靶點降序排列的前20 條通路見圖6，包括癌癥通路（pathways in cancer）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）等通路。

圖6 抗前列腺炎作用靶點的通路富集

2.2 指標性成分含量測定

2.2.1 混合對照品溶液制備 依據本課題組前期對地上部分提取分離的結果，喬松素與蘆丁得到量較多；刺甘草查耳酮為甘草屬特有，故以蘆丁、刺甘草查耳酮、喬松素為指標性成分。分別精密稱取對照品蘆丁、刺甘草查耳酮、喬松素適量，加甲醇制得質量濃度分別為3.26、3.02、4.96 mg·mL-1的單組分對照品儲備溶液；精密吸取上述溶液各1.0 mL，用甲醇定容至100 mL，制得含蘆丁32.6 μg·mL-1、喬松素49.6 μg·mL-1、刺甘草查耳酮30.2 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取烏拉爾甘草粗粉（過0.7 mm 篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液50 mL，密塞，稱量，加熱回流1 h，放冷，稱量，用70%甲醇水溶液補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續濾液25 mL，蒸干，殘渣加10 mL 水溶解，置于分液漏斗中，加入等量乙酸乙酯萃取，至乙酸乙酯層變無色，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，殘渣加甲醇適量使其溶解并轉移至2 mL 量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 色譜條件 采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為35 ℃，以乙腈（B）-0.1%甲酸（A）為流動相，梯度洗 脫（0～9 min，10%～27%A；9～10 min，27%～30%A；10～15 min，30%～33%A；15～18 min，33%～36%A；18～22 min，36%～37%A；22～30 min，37%A；30～32 min，37%～42%A；32～37 min，42%～60%A）；流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為289 nm，進樣量為10 μL?；旌蠈φ掌啡芤杭肮┰嚻啡芤旱纳V圖見圖7。

圖7 混合對照品及甘草地上部分樣品色譜圖

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 線性關系考察 精密吸取2.2.1 項下混合對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，用甲醇溶液定容至10 mL，混勻，制成系列質量濃度的線性關系考察混合對照溶液。分別進樣10 μL，按2.2.3 項下色譜條件進行分析，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），得3 個成分的回歸方程，見表2。

表2 甘草地上部分中3個成分的線性關系

2.2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.2.3 項下色譜條件連續進樣6 次，依次測定峰面積，結果顯示，蘆丁、刺甘草查耳酮和喬松素峰面積的RSD 分別為0.20%、0.45%、0.32%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液10 μL，按2.2.3項下色譜條件，于0、1、2、4、8、12、24 h分別進樣測定，結果顯示，蘆丁、刺甘草查耳酮和喬松素峰面積的RSD 分別為1.90%、1.20%、1.60%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.4.4 重復性試驗 取同一批甘草地上部分6份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，并按2.2.3項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，測得蘆丁、刺甘草查耳酮和喬松素峰面積的RSD 分別為1.13%、0.89%、1.10%，表明重復性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取2.2.4.4 項下已測含量的甘草地上部分粗粉6 份，每份約0.50 g，分別加入蘆丁、刺甘草查耳酮、喬松素對照品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.3 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算樣品中3 個成分的平均加樣回收率及RSD，結果見表3。

表3 甘草地上部分成分加樣回收率試驗

2.2.5 樣品含量測定 取3 批烏拉爾甘草地上部分樣品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.3項下色譜條件進樣測定，計算樣品中3 個成分的含量，結果見表4。

表4 甘草地上部分樣品中3個成分含量測定結果mg·g-1

3 討論

3.1 基于網絡藥理學的甘草地上部分成分抗前列腺炎可能作用機制探討

基于SwissTargetPrediction 數據庫，喬松素可能作用mTOR、ESR1、SRC、PIK3CA、PTGS2 等多個核心靶點來發揮抗前列腺炎的作用。mTOR 是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，是Akt 最重要的底物之一，而Akt處于PI3K/Akt信號轉導通路的核心部位，在細胞的增殖、生存及凋亡和細胞惡變的產生中扮演重要角色。Kinkade 等[9]報道Akt/mTOR 信號通路與前列腺癌的進展及轉移相關。從表2 可看出，Akt1 度值最高，為核心靶點之一。另外，從圖6 看出，PI3K/Akt 信號傳導通路富集明顯，是細胞內重要的信號傳導途徑之一，通過多種重要相關因子調節前列腺癌細胞的生長、增殖，促進細胞運動、侵襲，抑制細胞凋亡，促進血管生成，進而治療前列腺炎。有研究指出，與前列腺增生的發生、發展有關的生長因子主要包括表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維生長因子（b-FGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、轉化生長因子-β（TGF-β）、血管內皮生長因子（VEGF）[10]，從圖3 中可以看出山柰酚、異甘草素、槲皮素對EGF 可能具有一定作用。

3.2 指標性成分的含量測定

3.2.1 樣品提取方法的選擇 采用甲醇為提取溶劑，分別考察了超聲提取和回流提取方法，發現回流提取含量較高?？疾炝?0%甲醇、70%甲醇、甲醇、30%乙醇、70%乙醇、乙醇6 種溶劑對提取率的影響，結果發現70%甲醇提取率最高，故選用70%甲醇作為提取溶劑。

3.2.2 流動相的確定 考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸4 個溶劑系統。結果顯示，以乙腈-0.1%甲酸為流動相，所得色譜峰峰形較好，分離效果最佳。

3.2.3 指標性成分的確定 網絡藥理結果顯示，山柰酚、槲皮素、喬松素為發揮抗前列腺炎的重要成分，但在本課題組前期對地上部分含量測定研究中發現，山柰酚、槲皮素含量低，不易測得，且兩者在藥用植物中廣泛存在，而刺甘草查耳酮為甘草屬特有。依據本課題組前期對地上部分提取分離的結果，喬松素得到量最多，這也是選取其作為地上部分指標性成分的原因之一。