基于網絡藥理學的補腎和脈方治療高血壓作用機制研究△

張李慧，蘇文革

1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學 附屬醫院，山東 濟南 250011

我國高血壓人口調查結果顯示，近30 年，高血壓患病率不斷上升，目前約有30%的成年人患有高血壓[1-4]。由于高患病率和伴隨的血管風險，高血壓是中國腦血管疾病（CVD）死亡的最重要原因之一[4]。多項研究結果表明，高血壓治療率和控制率分別低于50%和20%[5-11]，因此，對其的防控成為一項國家公共衛生重點工作[12]。

根據患者頭暈、頭痛、眩暈等主要臨床證候，高血壓屬于中醫學“眩暈”“頭痛”范疇[13]；如果以心慌、胸悶、胸痛為主要臨床表現，則屬于“心悸”“胸痹”范疇；如果患者出現突然昏仆、神志模糊不清、抽搐、半身不遂、口舌歪斜等癥狀，就屬于“中風”范疇。中醫上本病以肝腎陰陽失調為本，風、火、痰、瘀為標。治療原則以調整陰陽、補虛瀉實為主。虛證者以肝腎陰虛為主，采用滋補肝腎；實證者根據具體情況分別施以潛陽、瀉火、化痰、逐瘀等法[13]。

補腎和脈方（生黃芪、黃精、桑寄生、淫羊藿、炒杜仲、女貞子、懷牛膝、澤瀉、川芎、當歸、地龍）是在傳承山東中醫藥大學附屬醫院周次清教授“從肝腎分期論治高血壓”專病學術思想的基礎上，通過長期臨床實踐和系列化的臨床研究，依據補腎經方腎氣丸、調肝經方當歸芍藥散合方而開發的現代制劑，多項臨床研究表明，其可以有效降低收縮壓和縮小脈壓，延緩動脈硬化進程，形成了局部降壓優勢，具有更全面的心血管保護效應[14-18]。但中藥具有多組分特性，其作用于機體的機制也相對復雜，通過動物實驗或細胞實驗的方法研究中藥分子機制相對困難，而且會耗費大量人力物力。系統生物學的發展為明確中醫藥發揮療效的分子機制提供了新的研究思路[19-21]。因此，本研究基于網絡藥理學的方法，分析補腎和脈方的有效活性成分和作用靶點，進一步預測補腎和脈方治療高血壓的靶點，并對相關靶點進行通路富集分析，探討補腎和脈方治療高血壓的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物活性化合物及其作用靶點預測

基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）預測補腎和脈方活性成分及作用靶點。將補腎和脈方中藥物（生黃芪、黃精、桑寄生、淫羊藿、炒杜仲、女貞子、懷牛膝、澤瀉、川芎、當歸、地龍）輸入TCMSP中，查詢獲得各味藥活性成分，并基于吸收、分布、代謝、排泄（ADME）參數，按生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18進行篩選，獲得藥物活性成分。由于地龍未在TCMSP中獲得有效成分，故未納入此次分析研究中。再通過TCMSP查找藥物活性成分的作用靶點，并于UniProt網站搜索得到每個成分靶點對應的靶標基因。

1.2 藥物-成分-靶點網絡構建

將上述各藥物的化學成分及其作用靶點上傳至Cytoscape 3.6.1 軟件進行補腎和脈方藥物-成分-靶點網絡的構建。

1.3 疾病靶點檢索

通過檢索TTD 數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、OMIM 數據庫（https://www.omim.org/）、DrugBank 數據庫（https://www.drugbank.ca/）、GAD 數據庫（https://geneticassociationdb.nih.gov/）、DisGeNET 數據庫（https://www.disgenet.org/search）及PharmGKB 數據庫（https://www.pharmgkb.org/），以“hypertension”為關鍵詞進行高血壓的疾病靶點檢索。對從這6 個數據庫獲得的檢索結果進行匯總、對比分析并取交集，最終獲得高血壓疾病相關靶標基因。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建

對1.1項下獲得的補腎和脈方相關靶點和1.3項下獲得的高血壓相關靶點取交集，作為補腎和脈方治療高血壓病的靶點。然后上傳至STRING 11.0數據庫（http://string.embl.de/）進行處理，建立PPI網絡。

1.5 網絡拓撲分析

運用Cytoscape 3.6.1 軟件對PPI 網絡進行拓撲分析，篩選出核心靶點，即關鍵節點（Hub 節點）。對于PPI 網絡中的每個節點，選擇度（degree）[22]、介數中心性（betweenness centrality）[23]、接近中心性（closeness centrality）[24]3 個參數對網絡中的節點進行評價。Hub節點的閾值是各參數對應的中值。

1.6 富集分析

通過基因富集分析在線工具DAVID 6.8 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對獲得的關鍵靶點進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

2 結果

2.1 補腎和脈方活性成分篩選和靶點預測

通過TCMSP 檢索獲得補腎和脈方活性成分923 個，根據OB 和DL 條件進行篩選，得到有效活性成分110 個，部分活性成分信息見表1。對110 個活性成分進行靶點預測，最終得到166 個藥物潛在靶點，部分靶點信息見表2。

表1 補腎和脈方部分活性成分信息

表2 補腎和脈方部分靶點信息

2.2 藥物-成分-靶點網絡構建

應用Cytoscape 3.6.1 對補腎和脈方活性成分及預測的作用靶點構建關系網絡，見圖1。

圖1 補腎和脈方藥物-成分-靶點網絡

2.3 高血壓相關靶點

由TTD、OMIM、DrugBank、GAD、PharmGKB、DisGeNET 檢索得到高血壓病相關靶點分別為66、200、166、747、129、277 個，去重后為1169 個，包括花生四烯酸鹽5-脂氧合酶（arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5）、前列腺素G/H 合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、轉錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、表皮生長因子（pro-epidermal growth factor，EGF）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等靶點。

2.4 PPI網絡構建

通過成分靶點與疾病靶點取得交集得到關鍵靶點83 個，上傳至STRING 數據庫進行處理，由于靶點基因PDE3A 與其他靶點未建立起聯系，故刪除，其他82個相關靶點建立PPI網絡。

2.5 網絡拓撲分析

將PPI網絡上傳至Cytoscape 3.6.1，共82個點，693 邊，進行拓撲特征分析。以度、介數中心性和接近中心性3 個主要參數為基礎，選取中值以上的靶點作為關鍵靶點，構建補腎和脈方治療高血壓作用的Hub 節點。經過2 次篩選后，得到11 個節點和43條邊，PPI網絡的拓撲篩選過程見圖2。

圖2 補腎和脈方治療高血壓PPI網絡拓撲分析

11個節點及其度值分別為IL-6（40）、內皮型一氧化氮合酶3（NOS3，39）、腫瘤壞死因子（TNF，35）、表皮生長因子（EGF，35）、VEGFA（34）、前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2，34）、過氧化氫酶（CAT，33）、乙酰膽堿酯酶（ACHE，31）、轉錄因子AP-1（JUN，30）、鈉依賴性血清素轉運體（SLC6A4，29）和凝血酶（F2，26），并體現在網絡圖中，這11個節點是該網絡的關鍵靶點（圖3）。

圖3 補腎和脈方治療高血壓關鍵靶點PPI網絡

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8 數據庫，將2.4 項下83 個關鍵靶點基因上傳并進行富集分析。GO分析包括分子功能（MF）、生物過程（BP）和細胞成分（CC），共得到315個GO條目（P≤0.05），其中與BP相關的條目最多，根據錯誤發現率（FDR）≤0.05 篩選，確定28個條目與BP相關，前20個BP條目主要涉及腺苷酸環化酶激活的腎上腺素能受體信號通路（adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway）、藥物反應（response to drug）、缺氧反應（response to hypoxia）、磷脂酶C 激活的G蛋白偶聯受體信號通路（phospholipase C-activating G-protein coupled receptor signaling pathway）、血管收縮的正調節（positive regulation of vasoconstriction）等生物分析過程，見表3。

表3 補腎和脈方治療高血壓靶點的GO生物過程分析

KEGG共得到53條信號通路，符合P≤0.05的有45 條，列舉前20 條通路，見表4。其中同時符合FDR≤0.05的通路主要涉及神經活性配體-受體相互作用通路（neuroactive ligand-receptor interaction）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）、5-羥色胺能突觸通路（serotonergic synapse）、環磷酸鳥苷-蛋白激酶信號通路（cGMP-PKG signaling pathway）、環磷酸腺苷信號通路（cAMP signaling pathway）、藥物代謝-細胞色素P450通路（drug metabolism-cytochrome P450）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、化學致癌通路（chemical carcinogenesis）8條。

表4 補腎和脈方治療高血壓靶點的KEGG富集分析

3 討論

補腎和脈方是楊傳華教授基于老年高血壓病“腎氣虧虛為本、血脈自病為標”的病機觀和“補腎氣、和血脈”治法觀創制而成，方中桑寄生、淫羊藿和黃芪填精益髓補腎，共為君藥，黃精、女貞子、炒杜仲滋補肝腎，與滲濕泄濁之澤瀉、行氣活血之川芎共為臣藥，佐以補血活血之當歸、引血下行之懷牛膝、清熱熄風通絡之地龍，共同起到補腎益精、活血疏肝之效，臨床用于防治高血壓病，療效較理想[14,16,25-26]。大多數高血壓患者的確切病因仍未知，中樞神經信號傳導失調、腎功能不全和血管反應性改變都與此有關，但這些異常如何發生及如何相互作用產生臨床高血壓的機制尚未明確。高血壓常伴隨著炎癥過程，免疫細胞在其中滲透并改變腎臟和血管的功能和結構。這種炎癥反應不僅促進血壓升高，而且還促進與高血壓相關的終末器官損傷[27]。其次，高血壓發病還與遺傳、飲食、應激、肥胖等相關，具體機制尚未完全闡明，目前公認的有交感神經系統活性亢進、水鈉潴留、腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）激活、內皮功能異常等[28]。

本研究通過PPI 拓撲分析發現，IL-6、NOS3、TNF、EGF、VEGFA、PTGS2 等可能是補腎和脈方治療高血壓的核心靶點。IL-6 及TNF 是機體重要的炎癥因子，參與炎癥反應，其水平降低可能減緩高血壓的進程[29-30]。在高血壓的發病中，血管平滑肌細胞異常增殖和肥厚占有十分重要的地位。NOS3 是合成一氧化氮（NO）的關鍵酶，NO 為內皮舒張因子，可以舒張血管、抑制血管平滑肌細胞增殖，進而改善血壓[31]。EGF 及VEGFA 都是生長因子，能夠促使細胞增殖，其中VEGF 水平升高是新生血管形成的生物標志物[32]。PTGS2 可與分布在血小板和內皮細胞上的前列環素受體G 蛋白偶聯受體聯結合激活G 蛋白，引起細胞內cAMP 水平升高，能夠抗血小板凝集，松弛血管平滑肌，參與血管的舒縮功能[33]。因此，結果提示，補腎和脈方可能通過作用于這些核心基因，參與其生物過程而起到降壓作用。

得到的KEGG 通路涉及cAMP信號通路，cAMP是多種血管活性物質的第二信使，一些舒血管物質（多巴胺、前列腺素E2、前列腺素I2等）可使腎內cAMP 水平升高，從而拮抗血管緊張素Ⅱ的縮血管效應[34]。而鈣信號通路可能通過選擇性阻滯鈣離子內流呈現降壓作用[35]。結合GO-BP 分析結果，及拓撲的核心靶點，推測補腎和脈方治療高血壓的潛在機制主要涉及抗炎、RAAS 系統、鈣拮抗劑作用、舒張血管及改善內皮功能等方面。

綜上分析，本研究運用網絡藥理學的方法，構建了補腎和脈方成分靶標-高血壓疾病靶標網絡，揭示出補腎和脈方治療高血壓的潛在作用機制，結果表明，其治療高血壓是多靶點、多途徑的直接或間接協同作用，為其臨床應用及進一步的藥理學研究提供參考。