基于土壤碳循環的丹參連作障礙機制研究△

崔寧，陳為序，李琦，李西文

1.中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100700；2.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014；3.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；4.上藥華宇（臨沂）中藥資源有限公司，山東 臨沂 276000；5.上海市藥材有限公司，上海 200002

連作障礙指連茬種植同一種或同一科植物，即使在正常的管理條件下，也會出現長勢變弱、產量降低、品質下降、病蟲害加重的現象[1]。丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰功效，用于治療胸痹心痛、脘腹脅痛、癥瘕積聚、熱痹疼痛、心煩不眠、月經不調、痛經經閉、瘡瘍腫痛等疾病[2]，已有近2000 年的臨床應用歷史。近年來，隨著心腦血管疾病發病率上升，丹參市場需求不斷增加[3]，但野生丹參供給量遠遠不能滿足市場需求。目前，丹參藥材多以栽培為主。在丹參人工種植過程中，連作障礙現象十分嚴重[4]。連作丹參長勢明顯減弱，根內部木質化、生長畸形，常伴有裂根等現象[5]。連作2 年丹參地下部鮮質量下降56.5%，干質量下降54.2%；根脂溶性成分二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量分別下降35.3%、32.3%、19.4%、3.4%；水溶性成分迷迭香酸和丹酚酸B分別下降66.9%和64.4%[6]。連作對高品質丹參藥材的生產造成極大影響。因此，揭示連作障礙機制，進而解決丹參連作障礙問題刻不容緩。

丹參連作障礙機制研究主要包括土壤理化性質改變[7]、化感自毒作用[8]及土壤微生物種群失衡[9]3 個方面，均從丹參生長環境變化的角度闡釋連作障礙機制，未包括丹參自身生理生長的影響，未從根本上揭示連作引起局部生態系統從正常動態偏離的復雜自適應現象。因此，迫切需要從新的角度剖析連作障礙現象，為丹參大規模連續種植提供技術支撐。

目前，連作障礙研究主要關注點在植物根系細胞的數量及土壤微生物的豐度，忽視了兩者的新陳代謝活力。然而，根系細胞及土壤微生物活性的高低能夠指示植物自身、植物與土壤之間及土壤內部物質代謝的旺盛程度，可以作為衡量土壤質量狀況、維持土壤肥力和藥材品質形成的一個重要指標，對維持藥用植物根際微生態系統功能具有重要作用。因此，可嘗試從連作對植物及土壤物質代謝抑制作用角度揭示連作障礙發生機制。

土壤呼吸指土壤釋放二氧化碳的過程，主要由微生物氧化有機物（異養呼吸）和根系呼吸（自養呼吸）產生。連作障礙本質是單一種群的連續種植對土壤的理化性質和微生物群落產生了影響，可以通過測定土壤呼吸間接反映根系細胞/土壤微生物活力水平，進而推測丹參與連作土壤之間的相互負反饋情況。開路式土壤碳通量測量系統可以測定碳通量及土壤呼吸速率，在土壤碳循環研究中廣泛應用[10-11]。本研究通過測定不同連作年限丹參根際微生態系統土壤碳通量，探索連作對土壤呼吸的影響，從土壤呼吸角度闡釋連作障礙現象，為后續連作障礙問題解決提供新思路。

1 材料

樣品經中國中醫科學院中藥研究所李西文副研究員鑒定為1～5 年生唇形科鼠尾草屬丹參Salvia miltiorrhizaBge.植株。碳通量檢測采用LI-8100 型土壤碳通量自動測量系統（美國LI-COR公司）。

2 方法

2.1 試驗設計

本研究試驗地點位于山東省臨沂市平邑縣上藥華宇（臨沂）中藥資源有限公司丹參基地。該地區平均年降水量707～759 mm，年平均氣溫13.5～14.0 ℃，年均相對濕度58.3%～59.8%，年平均日照153.7～254.4 W·m-2，土壤類型為低活性淋溶土，適宜丹參生長。

2019 年3 月，分別于空白地塊（前茬未種丹參）及連續種植丹參1～3 年樣地（各樣地丹參生長周期均為1 年）起壟，樣地種植丹參，種植參數相同。后經相同田間管理，于2019年11月測定空白及丹參連作地塊的土壤樣品。選擇連續氣溫及空氣濕度相對穩定的5 d，采用土壤碳通量自動測量系統測定空白及丹參不同連作年限地塊的土壤總呼吸。每個地塊于測定前1 d 隨機選擇36 個丹參植株，去除丹參地上部分及雜草，布置內徑20 cm 的土壤環，每個土壤環上緣露出地表2～3 cm。從7:00—17:00，每2 h 測定6 個土壤環，每個土壤環連續測定3 次。空白地塊于壟上直接隨機選點測定。系統設定參數為：Obs.Length 1:30，Dead Band 20 s，Obs.Count 3，Pre-Purge 15 s，Post-Purge 15 s。系統配置的溫度探針和水分傳感器即時測量地表下10 cm 處土壤溫度及濕度。

2.2 數據分析

采用SPSS 23.0 統計軟件對各地塊碳通量及溫濕度數據進行描述性統計、比較并作箱式圖；Microsoft Excel 2016 做柱狀圖及折線圖；R v.3.6.3軟件stats 包中prcomp 函數對各測量點的碳通量和土壤溫濕度數據進行主成分分析（PCA），并用ggplot2 包中ggplot 函數進行繪圖。

3 結果

3.1 土壤碳通量及土壤呼吸速率日變化特征

由圖1 可知，丹參不同連作年限地塊土壤呼吸速率日變化曲線均呈單峰，且變化趨勢一致，從7:00 開始，土壤呼吸速率隨著時間的推移逐漸增加，最高值均出現在13:00，隨后逐漸下降。除連作4 年地塊（圖1E）外，各地塊碳通量最低值均出現在7:00。

圖1 丹參根部土壤呼吸速率日變化曲線

3.2 丹參不同連作年限地塊土壤呼吸速率

如圖2所示，丹參種植1年和連作2年地塊土壤碳通量較高，均值分別為0.696 3、0.728 5 μmol·m-2·s-1，兩者之間差異無統計學意義；連作3 年地塊碳通量稍低，均值為0.603 2 μmol·m-2·s-1，與連作2 年地塊間差異有統計學意義（P<0.01）；連作4 年丹參地塊碳通量最小，均值為0.504 1 μmol·m-2·s-1，與連作3 年地塊間差異有統計學意義（P<0.05）；空白地塊土壤呼吸速率比各連作地塊低，碳通量均值為0.329 1 μmol·m-2·s-1，與其他地塊差異有統計學意義（P<0.001）。

圖2 丹參根部土壤碳通量比較

3.3 丹參不同連作年限地塊土壤溫濕度比較

3.3.1 土壤溫度的比較 丹參不同連作年限地塊土壤溫度日變化曲線趨勢基本一致（圖3）。除連作2 年地塊外，7:00—17:00 土壤溫度先降低后升高，最低值出現在9:00。統計分析發現，連續測定的5 d 內，不同連作年限地塊土壤溫度間差異無統計學意義（F=2.484）。

圖3 丹參根部土壤溫度日變化曲線

3.3.2 土壤濕度的比較 由圖4 可知，不同連作年限地塊土壤濕度間差異有統計學意義（F=18.785，P<0.01）。土壤濕度大小順序為連作1 年地塊（0.083 96 m3·m-3）>2年地塊（0.08140m3·m-3）>4年地塊（0.056 00 m3·m-3）>3年地塊（0.041 22 m3·m-3）>空白地塊（0.033 00 m3·m-3）。其中，連作1 年地塊與連作2 年地塊之間土壤濕度差異無統計學意義，連作3年、4年與空白地塊之間土壤濕度差異無統計學意義，連作2 年地塊與4 年地塊差異有統計學意義（P<0.01）。

圖4 丹參根部土壤濕度（,n=36）

3.4 PCA

如圖5 所示PC1（貢獻率40.20%）主要由土壤濕度（pca_loadings 值0.707 4）及碳通量（pca_loadings 值0.672 0）組成。PC2（貢獻率33.34%）主要由土壤溫度（pca_loadings值-0.950 1）組成。根據樣點重合率可將5 個地塊分為3 組：連作1 年、2 年地塊組，連作3 年、4 年地塊組和空白地塊組。數據顯示，連作1年與2年地塊之間、連作3年與4年地塊之間土壤相似度較高。由于主要依靠PCA1將樣點粗略分為3 組，說明連作地塊的主要差異因素為碳通量和土壤濕度。

圖5 丹參不同連作年限地塊PCA結果

4 討論

4.1 連作對土壤呼吸速率及土壤溫度、濕度的影響

4.1.1 連作對土壤呼吸速率的影響 土壤呼吸是指土壤釋放二氧化碳的過程，主要由生物氧化有機物和根系呼吸產生，另有極少部分是土壤動物和化學氧化釋放。土壤呼吸是一種復雜的生物學過程，受到多種因素的影響，如土壤溫度[12]、土壤含水量[12]、降水[13]、凋落物、土地利用方式[14]及土壤碳、氮含量等非生物因子等。其中，土地利用方式對土壤呼吸的影響主要是通過改變植被覆蓋和土壤性質實現[15]。植被覆蓋的改變可以影響土壤表層的能量平衡和近地層的空氣相對濕度。在植物根系作用下，土壤性質的改變一方面可以反作用于植物根系，另一方面對土壤微生物也會產生極大的影響。同種或同科植物連茬種植后，即使在正常的栽培管理條件下，也多會造成植株矮小、長勢變弱、土壤植被覆蓋度變小；連作還易造成土壤理化性質惡化、pH 降低、有機質含量降低、土壤次生鹽漬化等，從而對植物根系及土壤微生物產生抑制作用[16]。因此，土地利用方式與連作因素對土壤呼吸的作用方式相似。基于此，課題組考察了連作對土壤呼吸的影響，將土壤呼吸相關測定技術應用到藥用植物研究領域，為揭示連作障礙發生機制提供了新思路。

丹參根部土壤呼吸速率在丹參種植前2 年差異不大，但隨種植年限增加而顯著降低。從土壤生態環境角度來看，目前丹參主產區種植2 年后采收是適當的。此外，連作土壤呼吸速率下降、根系細胞及根際微生物物質代謝活性降低與連作導致丹參藥材多項指標下降一致，如連作丹參根變細、根長減小、根質量下降、產量降低、商品率下降等。丹參1 個種植周期后，需要開展輪作或進行土壤改良。空白地塊的碳通量數值最低，可能是由于空白地塊未種植丹參，土壤微生物缺乏根系分泌的營養物質，在微生物豐度、多樣性及代謝活性等方面與丹參種植地塊產生差異所致。

4.1.2 連作對土壤溫度、濕度的影響 本研究中，不同連作年限地塊的土壤溫度差異無統計學意義，說明在測定時間范圍內，丹參連作對土壤溫度未造成影響。且在測量時間內與其他地塊相比，空白地塊的溫度變化幅度最大，9:00 后升溫速率最快，推測其原因是空白地塊缺少丹參植株覆蓋。各地塊土壤濕度存在差異，大小順序為連作1年和連作2年地塊>連作4 年和連作3 年地塊>空白地塊。隨著連作年限增加，土壤濕度逐漸減小。這種規律可能是由連作對丹參植株的間接抑制作用產生。丹參在整個生長時期不斷向環境中釋放代謝產物。連續種植，代謝產物積累，達到限度后迫使土壤微生物組群落結構功能調整，異養呼吸發生變化。在此環境下，丹參植株的各項生長發育活動被抑制，根系自養呼吸減弱、持水能力減弱，最終造成土壤濕度降低。同時，土壤含水量降低、易缺水干旱，又會反過來脅迫連作丹參，抑制其生長。

4.2 “土壤碳循環減弱”導致丹參連作障礙的科學假設

目前，植物連作障礙機制研究主要包括3 個方面：土壤理化性質惡化[17]、化感自毒作用[18]及土壤微生物種群失衡[19]。基本內涵分別包括：1）土壤理化性質惡化機制。連作會造成土壤酸化，土壤養分有效性改變，進而影響植物生長與發育。2）化感自毒作用機制。大多數植物具有自毒作用，植物可以通過多種途徑釋放自毒物質對同茬或下茬同種或同科植物生長產生抑制作用。一種植物化感自毒物質通常含有多種成分，以混合物形式作用于周圍環境及植物體[20]。3）土壤微生物種群失衡機制。連作使土壤中微生物種群結構變化、菌群多樣性改變、有益菌減少、有害菌增多、土壤生態功能紊亂，進而造成連作障礙。然而，以上3 種機制均無法全面揭示植物連作障礙現象本質。其中，土壤理化性質惡化機制究其根本應為植物和（或）微生物對環境的響應，并非主動改變。植物化感自毒作用機制因受目前科技水平限制，無法系統考察一種植物的所有自毒物質[21]，也就無法進行準確的機制內涵詮釋和有效驗證。根際微生物失衡機制研究受數據庫和人工培養技術限制，無法準確定義連作相關核心微生物種群，也無法進行有效的結果驗證[22]。

目前，丹參的連作障礙發生機制不明確，且與整個植物學相比，其機制基礎研究相對滯后。研究表明，丹參連作使土壤pH 降低[23]，頭茬到四茬土壤pH 由8.02 降至7.32[24]，土壤中多種酶活性降低[25]，其他土壤理化指標變化研究較少，且關于丹參化感自毒物質的研究尚無報道。丹參須根腐解可造成多種物質累積水平增加[26]，但對增加的腐解產物需進行效應驗證。經過短期連作土壤擴增子測序分析發現，丹參連作使根際土壤細菌數量減少[27]，真菌數量增加[28]，功能微生物群落數目改變，多樣性指數減小，但未有長期的跟蹤研究報道。

本研究表明，丹參連作使根際微生態系統土壤呼吸減弱，說明連作在減少根系細胞數量（體現在連作丹參根部萎縮、變細、變短及根質量減少等）、改變根際微生物相對豐度及多樣性的同時，對土壤碳循環過程也具有抑制作用。土壤呼吸速率變化是丹參根和根際微生物的整體表現。在此基礎上，本課題組提出丹參連作障礙機制“土壤碳循環減弱”的科學假設，即連作丹參代謝產物大量積累造成根際微生態系統碳循環減慢，進而抑制丹參根系生長發育，改變根際微生物組結構，造成土壤微環境變化。該假設與原有3 種機制相比，把丹參根部生理現象與環境變化很好地結合起來，而不是把生態環境因素單獨處理，相關驗證研究正在進行中。本研究從土壤微生態系統碳循環的角度揭示丹參連作障礙現象，為進一步解決連作障礙問題提供思路。