Box-Behnken響應面法優化胡黃連苷提取工藝△

杜昊忱，屈玲霞a，郝大偉，楊梅，畢艷艷，關永霞*，張貴民

1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；3.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276006

胡黃連是玄參科植物胡黃連Picrorhiza scrophulariifloraPennell 的干燥根莖，主要分布于我國西藏、云南和四川的高原地區，能退虛熱、除疳熱、清濕熱，主要用于骨蒸潮熱、小兒疳熱、濕熱瀉痢、黃疸尿赤、痔瘡腫痛[1]。胡黃連中有效成分主要為環烯醚萜苷（胡黃連苷）類、葫蘆素類及酚苷類，具有保肝利膽、抗腫瘤、抗糖尿病等多種功效[2]。其中，胡黃連苷類成分可對抗釋放自由基誘導的肝損傷，并可以改善肝臟中膽固醇的代謝，對肝臟具有保護作用[3]。

本課題組通過硅膠柱色譜分離得到的胡黃連苷為中藥五類新藥，具有清熱利濕、保肝、利膽、降酶的藥理作用，主要用于肝膽濕熱證肝炎或化學品及藥物毒性造成的肝損害。

現階段，胡黃連提取方法主要有乙醇回流提取法[4]、滲漉法[5]、浸漬法[6]、二氧化碳超臨界萃取法等，多采用正交設計法或均勻設計法評價最佳提取工藝，但這些方法不能在給出的整個區域找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式，從而無法找到整個區域中因素的最佳組合和響應的最優值?？紤]到正交設計法和均勻設計法的局限性，本研究在單因素試驗基礎上，以胡黃連提取物出膏率及胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ轉移率為指標，用Box-Behnken 響應面法[7]對胡黃連提取工藝進行優化。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀；R2002 型旋轉蒸發器（上海申順生物科技有限公司）；SHB-B95型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；XS204型電子分析天平（Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

對照品胡黃連苷Ⅰ（批號：111727-201702，純度：95.6%）；胡黃連苷Ⅱ（批號：111596-201805，純度：93.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；高效液相色譜用試劑均為色譜純；分析用試劑均為分析純。

胡黃連（產地為西藏自治區，批號：190401）經中藥制藥共性技術國家重點實驗室范建偉高級工程師鑒定為玄參科植物胡黃連Picrorhiza scrophulariifloraPennell的干燥根莖。

2 評價指標的測定

2.1 出膏率的測定

精密吸取相當于2 g 原藥材量的胡黃連提取液，置已干燥至質量恒定（W1）的蒸發皿中，熱風循環干燥箱中干燥，放置室溫后精密稱質量（W2）。

2.2 胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ轉移率的測定

2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（35.0∶65.0∶0.1）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：275 nm；進樣量：10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ對照品適量，加甲醇制成含胡黃連苷Ⅰ1.250 mg·mL-1、胡黃連苷Ⅱ3.444 mg·mL-1的溶液，即得對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液3 mL 置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密吸取各提取液0.5 mL，置于50 mL量瓶中，精密加甲醇至刻度線，搖勻即得。

2.2.4 胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ轉移率測定 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL 注入色譜儀，按2.2.1 項下色譜條件測定胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ的峰面積。

2.2.5 方法學考察 線性關系考察：精密移取2.2.2 項下對照品溶液，分別對對照品溶液進行0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 倍稀釋，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積值。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，并線性回歸，得胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ的回歸方程分別為Y=10 836X+22.585（r=0.999 3），線性范圍0.003 8～0.150 0 mg·mL-1；Y=12 217X+10.21（r=0.999 7），線性范圍0.010 3～0.413 3 mg·mL-1。

精密度試驗：取同一對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，連續進樣6 次，計算RSD。結果，胡黃連苷Ⅰ峰面積的RSD 為3.41%，胡黃連苷Ⅱ峰面積的RSD 為2.67%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24、48 h，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算RSD。結果胡黃連苷Ⅰ峰面積的RSD為2.11%，胡黃連苷Ⅱ峰面積的RSD 為3.27%，表明樣品48 h內穩定性好。

重復性試驗：取同一供試品溶液6 份，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，計算RSD。結果，胡黃連苷Ⅰ含量的RSD 為2.76%，胡黃連苷Ⅱ含量的RSD為3.27%，表明該方法的重復性好。

加樣回收率試驗：分別取已知含量的胡黃連提取 液6 份，分別按照1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2 比例加入胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ對照品，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算回收率和RSD。結果，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ平均回收率分別為103.98%、101.34%，RSD分別為3.41%、2.75%。

3 單因素考察試驗與結果

單因素考察主要考察提取溶劑、液料比、提取時間、提取次數，在前期預試驗的基礎上，將提取溶劑的考察條件定為50%、70%、95%乙醇和水；液料比考察條件定為12∶1、16∶1、20∶1、24∶1；提取時間考察條件定為1.5、3.0、4.5、6.0 h；提取次數考察定為1、2、3、4 次。在各項考察條件中選出1 個最優條件作為后續的提取條件，并為最終的響應面優化條件提供依據。

3.1 提取溶劑的單因素考察

取胡黃連粗粉150 g，分別選用50%、70%、95%乙醇和水為提取溶劑，液料比為16∶1，提取時間為3 h，提取次數為3 次，合并濾液后回收溶劑得稠膏，備用。按2.1 項下方法進行出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉移率和胡黃連苷Ⅱ轉移率的測定。結果見表1。

表1 乙醇體積分數對胡黃連苷提取工藝的影響

由表1 可知，95%乙醇作為提取溶劑，胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ轉移率高，故選擇95%乙醇為提取溶劑。

3.2 液料比的單因素考察

取胡黃連粗粉150 g，選用95%乙醇為提取溶劑，液料比考察條件定為12∶1、16∶1、20∶1、24∶1，提取時間為4.5 h，提取次數為3 次，合并濾液后回收溶劑得稠膏。按2.1 項下方法進行出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉移率和胡黃連苷Ⅱ轉移率測定。結果見表2。

表2 液料比對胡黃連苷提取工藝的影響

由表2可知，液料比為12∶1、16∶1、20∶1時，隨著液料比的增加，出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉移率和胡黃連苷Ⅱ轉移率均增加，當液料比為24∶1時，胡黃連苷Ⅰ轉移率和胡黃連苷Ⅱ轉移率又略下降。因此，選擇液料比為16∶1～24∶1 進行后續Box-Behnken 響應面優化。

3.3 提取次數的單因素考察

取胡黃連粗粉150 g，選用95%乙醇為提取溶劑，液料比考察條件定于20∶1，提取時間為4.5 h，提取次數分別為1、2、3、4 次，合并濾液后回收溶劑得稠膏，備用。按2.1 項下方法進行出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉移率和胡黃連苷Ⅱ轉移率的測定。結果見表3。

表3 提取次數對胡黃連苷提取工藝的影響

由表3可知，提取次數超過3次時，胡黃連苷Ⅰ轉移率和胡黃連苷Ⅱ轉移率略微有點下降。因此，選擇提取次數在2～4 次進行后續Box-Behnken 響應面優化。

3.4 提取時間的單因素考察

取胡黃連粗粉150 g，選用95%乙醇為提取溶劑，溶劑用量3.0 L，提取次數為3 次，提取時間分別為1.5、3.0、4.5、6.0 h，合并濾液后回收溶劑得稠膏，備用。按2.1項下方法進行出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉移率和胡黃連苷Ⅱ轉移率的測定。結果見表4。

由表4 可知，隨著提取時間的增加出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉移率和胡黃連苷Ⅱ轉移率均增加，當提取時間為6 h 時，胡黃連苷Ⅰ轉移率和胡黃連苷Ⅱ轉移率又略下降。因此，選擇提取時間為3.0～6.0 h進行后續Box-Behnken響應面優化。

表4 提取時間對胡黃連苷提取工藝的影響

4 Box-Behnken設計響應面優化提取工藝

4.1 Box-Behnken設計試驗與結果

根據Box-Behnken 設計原理，稱取胡黃連粗粉150 g，分別以液料比（A）、提取次數（B）、提取時間（C）為考察因素，以出膏率、胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ轉移率及綜合得分（R綜）[8]為響應值，設計17 個試驗點，篩選各因素的最優條件。胡黃連苷提取工藝綜合評分指標見表5，Box-Behnken響應面的因素水平設計及結果見表6，響應面二次回歸方程方差結果分析見表7。

表5 胡黃連苷提取工藝綜合評分指標

利用Design-Expert v 10.0.7 軟件對表6 中的數據進行二次多元回歸擬合，R綜對各因素的二次多項回歸模型方程為R綜=-379.49+29.65A+29.07B+51.06C-0.44AB-0.76AC-1.02BC-0.59A2-2.02B2-3.49C2（r=0.977 0）。提示該模型擬合度較好，實驗誤差小，可用此模型進行分析和預測。進一步對方程進行方差分析，結果見表7。

表6 Box-Behnken響應面優選胡黃連苷提取工藝設計及結果

由表7 結果，對綜合評價指標R綜來說，A、B、A2和C2因素均達到極顯著水平（P<0.01）；交互項AC 影響差異有統計學意義（P<0.05）；交互項AB和BC的影響差異無統計學意義，失擬項影響差異無統計學意義，提示回歸方程擬合度良好。R綜建立的回歸整體模型其P<0.01，達到極顯著水平。各因素對R綜值的影響大小順序為A>B>C。

表7 Box-Behnken響應面優選胡黃連苷提取工藝二次回歸方程方差分析結果

4.2 響應面法優化提取工藝

利用Design-Expert 10.0.7 軟件得到二次回歸方程的響應面圖，以此評價試驗因素之間的交互強度，以確定最優工藝參數。見圖1～3。

由圖1 可知，當提取次數一定時，隨著液料比的增加，R綜逐漸增加，當液料比超過20∶1 時，R綜開始降低；當液料比一定時，隨著提取次數的增加，R綜逐漸增加，當提取次數超過3 次時，R綜增加緩慢。由圖2 可知，當提取時間一定時，隨著液料比的增加，R綜逐漸增加，當液料比超過20∶1 時，R綜略微降低；當液料比一定時，隨著提取時間的增加，R綜逐漸增加，當提取時間超過4.5 h 時，R綜變化不明顯。由圖3 可知，當提取時間一定時，隨著提取次數的增加，R綜逐漸增加，當提取次數超過3次時，R綜增加緩慢；當提取次數一定時，隨著提取時間的增加，R綜逐漸增加，當提取時間超過4.5 h 時，R綜開始下降。A 的曲面較陡峭，提示因素A 對響應值影響顯著，其次是B 和C。由等高線圖可知，液料比和提取次數、提取次數和提取時間交互作用的等高線圖沒有呈現橢圓形，說明液料比和提取次數、提取次數和提取時間交互作用不顯著；液料比和提取時間交互作用的等高線圖呈現明顯的橢圓形，說明液料比和提取時間交互作用顯著。

圖1 提取次數和料液比對R綜的響應面和等高線圖

圖2 提取時間和料液比對R綜的響應面和等高線圖

圖3 提取時間和提取次數對R綜的響應面和等高線圖

經Design-Expert 10.0.7 軟件優化得到胡黃連總苷類成分的最優提取工藝條件液料比為21.23∶1、提取次數3 次、提取時間4.61 h。結合實際所需，最終確定提取工藝為稱取液料比為20∶1，提取次數3次，提取時間4.5 h。

4.3 驗證實驗

稱取胡黃連粉末150 g，按優化的提取工藝進行3 次驗證實驗，得到出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉移率和胡黃連苷Ⅱ轉移率分別為45.12%、94.15%和91.98%，與預測值的相對誤差分別為0.57%、0.84% 和0.65%，提示優化得到的提取工藝穩定可靠。

5 結論

本實驗通過單因素試驗，確定了提取溶劑，以及液料比、提取時間、提取次數三因素的考察范圍。在此基礎上，運用Box-Behnken 響應面法獲得了胡黃連總苷的最優提取工藝：95%乙醇提取3 次，液料比為20∶1，提取4.5 h。該方法提取完全、操作簡單、穩定性好，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ轉移率高，可為將來胡黃連苷進一步分離純化提供參考。