動物用口服抗體的研究進展

王天蔚,郎巧利,楊 希,李周權,葛良鵬*

(1.重慶市畜牧科學院,重慶 402460;2.西南大學動物科學技術學院生物飼料與分子營養(yǎng)實驗室,重慶 400715;3. 四川省畜牧科學研究院,成都 610066)

腸道是動物重要的消化和免疫器官,腸道健康是保障動物健康的重要因素。 病原微生物可以通過感染腸道黏膜,影響正常的腸道功能進而影響動物健康[1-2],特別在動物的初生階段,由于腸道的發(fā)育及免疫系統(tǒng)不完善,易感染病原微生物,這將嚴重影響動物的健康,甚至導致其死亡[3-4]。

口服抗體作為一種被動免疫藥物,以口服的途徑將預先形成的抗體輸送至動物腸道粘膜,能夠立刻作用于腸道發(fā)揮抗體功能,起到治療或預防腸道病原感染的作用[5],是一種新型腸道保護策略。 相對于常規(guī)的注射免疫,口服抗體可更快的發(fā)揮抗體功能[6]。 同時,口服方式對抗體的純度要求較低,可通過廉價的蛋白表達系統(tǒng)表達抗體并將抗體伴隨載體一同飼喂動物[7],較為便捷。 因此,口服抗體具有廣闊的應用前景,本文就口服抗體的發(fā)展過程、作用機制、制備途徑、穩(wěn)定特性、對動物腸道健康保護作用的應用展開綜述,為口服抗體的研究提供參考。

1 口服抗體的發(fā)展過程

抗體的發(fā)現(xiàn)可追溯至19 世紀末,Behring 和Kitasato 發(fā)現(xiàn)血漿中含有抗白喉和破傷風毒素的物質[8],后稱之為抗體。 隨著對抗體研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)一些抗體以口服的方式飼喂給動物,也可以達到保障動物健康的效果。 目前,常見的口服抗體有卵黃抗體(immunoglobulin of yolk, IgY)、血液抗體以及基因工程抗體。

1893 年,德國醫(yī)生 Klemperer 等[9]在免疫蛋雞的試驗中發(fā)現(xiàn),經免疫的蛋雞所產雞蛋蛋黃中含有能夠中和免疫原的特異性蛋白質,即IgY。 自此,各國學者相繼對其分子結構、理化性質、制備工藝、檢測方法及應用等領域進行了廣泛而深入的研究。直到上個世紀末,有研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加IgY 可降低仔豬的腹瀉率、死亡率,且有效預防細菌和病毒引起的消化道疾病[10],這是人們首次將外源抗體以口服的方式飼喂動物并取得了預防疾病的效果。目前,卵黃抗體的研究較為廣泛,以其獲取方式的高效便捷、產量高等優(yōu)點在動物生產中得到了廣泛應用,但卵黃抗體存在通過蛋傳遞病原的風險。

20 世紀80 年代,有研究表明在斷奶動物的飼料中加入噴霧干燥血漿能夠提高動物的采食量、加快生長速度等[11]。 后續(xù)更多的研究表明,噴霧干燥血漿發(fā)揮作用的成分是其中的特異性抗體[12]。 自此,人們展開對口服血液抗體的研究。 血液抗體能否預防動物疾病取決于血液中是否含有特異性抗體,這點對血液抗體的來源提出了更高的要求。

進入21 世紀,隨著基因工程的發(fā)展,人們能夠獲取表達特異性抗體的基因序列,隨后根據(jù)用途對抗體加以修飾改造,利用蛋白表達技術實現(xiàn)了特異性重組抗體的大量表達,并在活體實驗中取得了良好的效果。 自此,越來越多的基因工程抗體作為口服抗體被開發(fā)出來。

2 口服抗體的作用機制

自然狀態(tài)下,動物腸道內含有自身抗體來保護腸道系統(tǒng),人們根據(jù)此類抗體的作用機制設計外源口服抗體,以期待外源抗體通過口服的方式能夠達到保護腸道健康的效果。 口服抗體主要通過以下方式發(fā)揮生物學功能:直接中和病原微生物,防止病原侵入;與病原微生物結合,抑制病原微生物繁殖;誘導抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用,殺死病原微生物(圖1)。

圖1 口服抗體作用機制示意圖Figure 1 Schematic diagram of the mechanism of action of oral antibody

2.1 中和病原微生物

病原與宿主腸道的粘附是其感染腸道的重要途徑[13-14],口服抗體進入腸道內,能夠與病原特異性結合、中和病原產物如酶和毒素,同時能夠在腸道粘膜形成一層覆蓋層,抑制病原的粘附。 外膜蛋白和鞭毛是細菌類病原體粘附腸道的重要毒力因子,參與腸細胞的粘附[15],是細菌運動和定植腸道的關鍵[16]。 口服抗體一般具有多個抗原結合位點,能夠與細菌外膜蛋白、鞭毛結合并具有類似包裹、凝集的功能,實現(xiàn)對細菌的快速清除,阻止細菌對腸上皮細胞的黏附。 Saberianfar 等[17]將抗體的重鏈可變區(qū)(variable domain of heavy-chain antibody,VHH)片段融合到豬分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A, SIgA ) 的 可 結 晶 片 段(crystallizable fragment, Fc)區(qū)域,在體外試驗中驗證了針對大腸桿菌黏附素的VHH-SIgA 抗體能與O145:Hnm、O111:Hnm、O26:H11 和 O157:H7 血清型大腸桿菌結合,并在顯微鏡下觀察到經抗體中和后的大腸桿菌粘附腸上皮細胞的能力明顯減弱。Vanmarsenille 等[15]利用擬南芥種子表達針對彎曲桿菌外膜蛋白和鞭毛的雞用口服抗體,將含有抗體的種子提取物加入培養(yǎng)彎曲桿菌的瓊脂中,發(fā)現(xiàn)其明顯減弱了彎曲桿菌的活性,將抗體稀釋加入后該抑制活性作用減弱。

2.2 抑制病原微生物繁殖

病毒類病原體進入動物腸道后,口服抗體可以與之結合,形成病毒抗體復合物。 病毒抗體復合物的形成可以干擾病毒在上皮細胞傳染中的復制過程,當復合物進入上皮細胞后被排泄至管腔中清除[18]。 例如,在極化上皮細胞的基底外側表面添加特異性抗病毒抗體可降低仙臺病毒、輪狀病毒的病毒滴度[19-20]。

2.3 抗體依賴細胞介導的細胞毒作用

抗體依賴細胞介導的細胞毒作用是抗體發(fā)揮功能的重要途徑,是指有殺傷性的免疫細胞通過其細胞表面的Fc 受體識別包被于靶抗原上的抗體Fc段,直接殺死病原微生物[21]。 其中,嗜中性粒細胞被證實參與抗體介導的免疫反應,研究表明嗜中性粒細胞的Fc 受體與抗體結合后會釋放一種化學誘導劑,誘導劑會誘導嗜中性粒細胞遷移發(fā)揮免疫功能直到病原微生物被消除[22]。 到目前為止,已經證實在病原體特異性抗體存在下,中性粒細胞對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的攝取增加[23]。參考這一抗體作用途徑,基因工程抗體融合了抗體的Fc 區(qū)域[24],期待口服抗體進入腸腔后能夠依賴免疫細胞發(fā)揮清除病原體的作用。

3 口服抗體的制備途徑

口服抗體主要有兩種制備途徑,一種是通過簡單純化從動物產品中獲取天然抗體,另一種是根據(jù)人們的意圖,通過基因工程外源表達特異性功能抗體。 在天然抗體中,卵黃抗體是母雞經特異性抗原刺激在孵育過程中由血清中的免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)轉移到卵黃中形成的[25],將蛋黃直接冷凍或噴霧干燥制成卵黃粉即可飼喂動物。 從動物血液獲取天然抗體主要有血漿噴霧和抗體純化兩種方式。 噴霧血漿(spray-dried plasma, SDP)是利用屠宰后動物的血液,經過抗凝、離心、噴霧干燥等過程得到的粗糙口服抗體產品[26]。 如需獲取更高純度的血液天然抗體,也可通過蛋白純化的方法從血清中提取抗體用于動物飼喂[27]。

基因工程抗體的制備結合了基因工程以及蛋白質工程技術,人們在基因水平對抗體分子進行切割、拼接或修飾,再通過真核細胞表達獲得抗體蛋白。 植物表達系統(tǒng)已被證明可生產高價值的聚合物蛋白,大量的研究表明植物可表達用于被動免疫的口服抗體[28]。 煙草[29]和擬南芥[30]可穩(wěn)定表達完整結構的SIgA,并且具有免疫活性,將表達目的抗體的轉基因植物與飼料一同飼喂動物,可達到口服抗體的預期效果[31]。 人們普遍認為細菌和酵母系統(tǒng)不能有效分泌組裝好的抗體,并且正確轉錄后修飾的抗體水平較低[32-33]。 但最近 Virdi 等[34]的研究表明,畢赤酵母可大量表達針對產毒性大腸桿菌的重組抗體,將含有表達抗體的酵母上清液經冷凍噴霧干燥后飼喂動物,能有效幫助動物抵御產毒性大腸桿菌的感染。

4 口服抗體的穩(wěn)定性

口服抗體是一種蛋白質,經口服途徑到達腸粘膜發(fā)揮作用前可能會被胃腸道消化系統(tǒng)水解,因此口服抗體在胃腸道中的穩(wěn)定性被認為是其發(fā)揮作用的關鍵因素。 在胃腸道中,口服抗體主要受到溫度、pH、蛋白酶的影響。 抗體的熱穩(wěn)定性相對其它蛋白質較好,大多數(shù)抗體在37℃的條件下仍能保持良好的生物學活性。 胃腸道內的pH 較低,會對口服抗體與抗原的結合有一定的影響[35],但不會造成抗體失活,酸性環(huán)境主要通過保障蛋白酶活性進而對口服抗體產生影響[36]。 在胃腸道中,口服抗體的活性主要受蛋白酶的影響。

不同種類口服抗體在胃腸道中的穩(wěn)定性差異非常大。 IgY 擺動性和柔韌性較低,結構穩(wěn)定,這可能是因為IgY 分子重鏈和輕鏈間存在一個富含脯氨酸殘基和甘氨酸殘基的轉換區(qū)。 Yokoyama 等[37]的研究發(fā)現(xiàn),IgY 能夠抵抗幼年動物胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的降解。

基因工程抗體是根據(jù)人們的意愿改造而成。Hu 等[38]模擬SIgA 的分子結構,利用中國倉鼠卵巢細胞表達出抗毒素的重組SIgA 和IgG,并通過蛋白純化獲得了高純度SIgA 和IgG 抗體。 在體外模擬胃腸道環(huán)境測試其穩(wěn)定性的過程中發(fā)現(xiàn),兩種抗體在37℃、pH=3.5、胃蛋白酶濃度2000 U/mL 的條件下孵育一夜后均被完全消化,但SIgA 的分解速度慢得多,表現(xiàn)出對pH、胃蛋白酶更強的抵抗力,并且SIgA 在整個過程均具有一定的抗原結合能力保留。基因工程表達IgA 抗體的VHH 較天然抗體具有更高的穩(wěn)定性,可能其特殊的氨基酸序列缺少蛋白酶的作用位點[39]。

在抵抗酶解作用的過程中,植物表達系統(tǒng)表現(xiàn)出了較大的優(yōu)勢。 植物細胞壁為抗體提供了一個屏障,抗體在植物組織基質中得到了較好的保護,能大幅減少蛋白酶的降解作用[40],同時植物表達的抗體鉸鏈區(qū)糖基化也一定程度上抵御胃蛋白酶的酶解[41]。 在豆科植物的種子中,含有蛋白酶抑制劑,也可以保護種子中的抗體不被酶解[42]。 同時,Schade 等[43]提出飼料中大量的其他蛋白質對抗體具有消化競爭作用,也有可能保障抗體的完整性。

5 口服抗體的應用

在口服抗體的應用研究中,口服抗體多以飼料添加或灌服的方式傳遞至動物腸道內,通過對實驗動物進行攻毒處理,并觀測實驗動物的生理狀況、生化指標和腸道病原微生物載量來評價口服抗體的功效。 口服抗體的基礎研究多以小鼠為實驗模型,其應用研究主要在豬、禽生產中,本文將口服抗體分為天然抗體和基因工程抗體來闡述其應用研究現(xiàn)狀。

5.1 天然抗體的應用

動物的血液中含有大量的抗體,主要以IgG 抗體為主。 研究表明,血液抗體經血漿噴霧干燥或者抗體純化后飼喂動物能夠保護腸道抵抗病原感染。Balan 等[44]從羊血清中提純抗體,并將其飼喂給大鼠,經腸炎沙門氏菌攻毒后發(fā)現(xiàn),與無抗體攝入的對照組相比,攝入抗體的大鼠在攻毒前后的日增重和日采食量無顯著變化,基本沒有沙門氏菌的感染癥狀。 Hedegaard 等[27]從豬血清中純化獲得天然IgG 抗體,以5 mg/d 的劑量飼喂斷奶仔豬,并用F4型大腸桿菌給予攻毒。 試驗發(fā)現(xiàn),飼糧中添加IgG抗體的仔豬表現(xiàn)出對大腸桿菌更強的抵抗力,回腸腸桿菌的細菌比例極顯著低于對照組仔豬,表明口服攝入的IgG 有效抑制了大腸桿菌對仔豬腸道的感染。 Bosi 等[45]在已感染產毒性大腸桿菌的仔豬飼料中添加6%的SDP,發(fā)現(xiàn)SDP 可顯著降低腫瘤壞死因子 α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)和白介素8(Interleukin-8, IL-8)的表達,改善了仔豬的感染癥狀,表明SDP 對大腸桿菌誘導的腸道炎癥具有保護效果。

卵黃抗體已廣泛用于防治動物腸道類疾病,主要應用于豬、禽生產中。 Vandeputte 等[46]在肉雞飼糧中添加5%的抗空腸彎曲桿菌的IgY 抗體,同時用彎曲桿菌對肉雞進行攻毒處理。 結果顯示,飼料添加特異性IgY 能顯著減少空腸彎曲桿菌定植的肉雞數(shù)量,使感染雞的總定植率從78%降低至15%。Mahdavi 等[47]的研究表明,飼糧中添加 0.2%和0.4%的特異性IgY 抗體對雛雞回腸中大腸桿菌O78:K80 的增殖具有明顯的抑制作用。 IgY 抗體同樣可應用于豬生產中,豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的急性、高度接觸傳染性消化道疾病,仔豬感染PEDV 的死亡率高達80%~100%,嚴重危害仔豬健康[48]。在Lee 等[49]的研究中,新生仔豬以500 mg/d 的劑量灌服特異性IgY 抗體,經PEDV 攻毒后的結果顯示,口服抗PEDV 的IgY 抗體顯著降低了仔豬的腹瀉率以及死亡率,且試驗組仔豬腸道僅觀察到輕微的腸道損傷,表明抗PEDV 的IgY 抗體有效地保護仔豬腸道免受PEDV 的感染。 由此可見,口服天然抗體可有效保護病原菌對動物腸道的感染,起到腸道疾病的預防和治療的作用。

5.2 基因工程抗體的應用

基因工程抗體主要經歷多克隆抗體、單克隆抗體和重組抗體三個階段。 上個世紀末,de 等[50]首次將單克隆抗體以口服的方式供給動物,通過BABL/c 小鼠制備針對F4 型大腸桿菌受體表位的單克隆抗體,將純化腹水后得到的抗體以15 mg/d的劑量飼喂剛出生的無菌仔豬,同時對仔豬進行F4型大腸桿菌的攻毒處理。 結果顯示飼喂抗體有效降低了仔豬的死亡率,并且當抗體飼喂停止后,仔豬出現(xiàn)了感染癥狀,表明仔豬對F4 大腸桿菌的抵抗依賴于經口服攝入的單克隆抗體。

基因工程抗體的口服應用研究主要集中在重組抗體方面。 單鏈抗體(single chain antibody fragment, scFv)由抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過15~20 個氨基酸的短肽連接而成,具有抗原識別功能。 Zimmermann 等[31]利用噬菌體展示抗體庫,獲得了抗艾美耳球蟲(Eimeria)單鏈抗體片段,并在轉基因豌豆種子中成功表達該抗體。 將表達抗體的豌豆種子制成碎片飼喂家禽,發(fā)現(xiàn)豌豆種子可以保護抗體不被胃腸道蛋白酶降解,同時表達抗體的豌豆種子顯著降低了家禽Eimeria的感染率。 Zhang等[51]將抗PEDV 病毒單鏈抗體基因克隆至pet-28表達質粒中重組表達抗PEDV 病毒單鏈抗體,仔豬以25 mg/d 的劑量攝入該抗體后表現(xiàn)出輕微或無PEDV 臨床癥狀,病毒載量明顯減少,無腸道病變,表明口服單鏈抗體具有預防和治療PEDV 的作用。駱駝體內存在天然缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy chain of antibody, HCAbs),此類抗體的抗原結合位點僅由重鏈的可變區(qū)VHH 單結構域構成[52]。 VHH抗體具有高度的親和力、特異性和穩(wěn)定性,并且它們可以在惡劣的化學和熱條件下保持功能[39]。 由于它們的互補性決定區(qū) 3 ( complementarity determining region 3, CDR3)的擴展,該區(qū)域呈凸環(huán)型,具有更多與抗原識別的表位[53]。 Tokuhara等[54]利用轉基因水稻表達抗輪狀病毒的特異性的抗體片段VHH,在小鼠攻毒實驗中發(fā)現(xiàn),口服VHH可顯著降低免疫功能低下和免疫缺陷小鼠的輪狀病毒載量。 該抗體在長期保存和煮沸后仍保持體外中和活性,即使在94℃下熱處理30 min,也能對小鼠產生保護作用。 Pant 等[55]利用重組乳酸菌表達了針對輪狀病毒的VHH 抗體,小鼠口服攝入后,可顯著降低其由輪狀病毒引起的腹瀉程度和病毒載量。 由此可見,VHH 對病毒的侵染具有一定的效果,然而單個VHH 抗體是一價的,在機體內容易被迅速清除,通過將VHH 融合到抗體的Fc 結構域可以在發(fā)揮功能的同時避免這些缺點。 VHH 與Fc 結構域的融合將通過增加Fc 受體的大小和相互作用而延長體內半衰期[56],同時融合抗體確保抗體的多價性,這對細菌凝集交聯(lián)和防止細菌附著于腸絨毛腸細胞受體極為重要[57]。 Virdi 等[24]成功地將針對F4 型產毒大腸桿菌的VHH 片段融合至豬IgA、IgG的Fc 區(qū)域,在擬南芥種子中表達,并通過飼喂種子的方式使仔豬獲得抗體。 在仔豬的攻毒實驗中,每天接受80 mg VHH-IgA 的仔豬腸道中產毒大腸桿菌載量呈下降趨勢,免疫反應明顯降低,體增重高于其它實驗組,表明VHH-IgA 保護了大腸桿菌對仔豬腸道的感染,而VHH-IgG 不能抵抗大腸桿菌感染。 VHH-IgG 不能保護仔豬腸道感染的原因可能是VHH-IgA 在胃腸道中具有更好的穩(wěn)定性和更高的保留效率[58]。 同樣,VHH-IgA 也在畢赤酵母中成功表達,并在仔豬攻毒實驗中取得了相同的效果[34]。

綜上,特異性口服抗體具有保護動物腸道健康的作用。 在動物養(yǎng)殖領域中,人們需結合實際情況,可將口服抗體用于治療或預防高發(fā)疾病。 在這一過程中,口服抗體的特異性和使用劑量是其發(fā)揮功能的關鍵因素。 通常情況下,口服抗體不具備廣譜性,僅針對某一病原或某一類病原具有抗體功能,因此,需根據(jù)疾病病原選用特異性口服抗體。口服抗體的使用劑量受多方面因素影響,在實際應用過程中需根據(jù)具體情況添加合適的抗體劑量。其中,動物物種是影響口服抗體劑量的重要因素,以上研究表明豬類口服抗體的使用劑量高于禽類、鼠類,可推斷高體重的物種所需抗體劑量更高。 同時,口服抗體通常不以高純度形式作為飼料添加劑,往往伴隨其表達載體一同攝入動物體內,需要結合抗體的表達載量計算飼料中的添加量。 其次,口服抗體與病原的親和力以及病原載量也將影響抗體的使用劑量,以上研究中,大多以細菌攻毒為試驗模型,而在實際生產中的疾病預防與治療情況將與此不同,口服抗體的使用劑量也將不同。 因此,口服抗體使用劑量應依據(jù)實際情況、應用目的而界定。

6 總結及展望

口服抗體作為一種被動免疫制劑可以針對腸道感染病原體給予動物腸道保護作用,尤其在初生動物腸道免疫系統(tǒng)不完善的情況下效果尤為明顯。近些年來,口服抗體對動物保護作用的研究不斷增加,取得了不錯的進展,但仍存在以下不足:(1)口服抗體對整個腸道免疫系統(tǒng)的影響缺乏系統(tǒng)性研究;(2)口服抗體與腸道的相互作用機制仍需進一步研究。 未來,人們將更著眼于基因工程類抗體,對抗體的穩(wěn)定性、功能性、高效性做更深入的研究,同時口服抗體是否能通過口服途徑為非腸道型疾病給藥也是值得探究的方向。 總之,繼續(xù)深入全面、系統(tǒng)的研究口服抗體對腸道的保護作用及防護機制,對保障動物健康、實現(xiàn)抗生素的替代具有重大意義。