提高小兒健胃咀嚼片質量標準的研究

張笑笑，張 鑫，賀敬霞，張曉莉，黨艷妮，陳衍斌*

(1.陜西國際商貿學院，咸陽 712046；2.陜西步長高新制藥有限公司，西安 710075)

小兒健胃咀嚼片是由沙參、稻芽、白芍、玉竹、炒麥芽、山楂、麥冬、陳皮等11味藥材經提取制成的中藥復方制劑，具有健脾消食、清熱養陰的功效，主治脾胃陰虛所致的食欲減退和消化不良[1]。方中荷葉、麥芽在處方中占比較大，本研究遵循以主藥成分為控制要素的原則，并增加對制劑主藥荷葉、麥芽的薄層色譜(TLC)鑒別。麥芽性平味甘，歸脾、胃經，主要功效是行氣消食、健胃開脾[2-3]，在小兒健胃咀嚼片中發揮重要作用。陳皮中主要含黃酮類化學成分，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效[4-5]。近年來研究發現，橙皮苷對胃腸有興奮作用，能明顯拮抗阿托品、腎上腺素引起的小腸胃排空和小腸推進抑制作用，對平滑肌也有明顯的先興奮后抑制作用，是健胃消食類藥物的主要成分之一[6-7]。

小兒健胃咀嚼片藥品標準于2010年獲得國家食品藥品監督管理局的審批，并已實施。標準中通過TLC鑒別對北沙參、白芍、荷葉進行鑒定，通過高效液相色譜法(HPLC)對陳皮中橙皮苷的含量進行控制，但其標準控制項較單一，難以對小兒健胃咀嚼片進行全面的質量控制。因此，本研究在現行質量標準的基礎上[1]，參考相關文獻，增加了荷葉藥材(荷葉堿)和麥芽藥材的TLC鑒別[8-9]，建立了一種快速、高效且能同時測定小兒健胃咀嚼片中橙皮苷和蕓香柚皮苷含量的測定方法[10-12]，旨在為小兒健胃咀嚼片的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ACQuity Class UPLC系統，包含二元高壓泵在線脫氣裝置、自動進樣器、柱溫箱(美國Waters公司)；MS403TS102型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；ZF-2C型暗箱式自動紫外分析儀(上海安亭電子儀器廠)；KQ-800KDE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct 8型純水機[默克化工技術(上海)有限公司]；光電二級管陣列(PDA)檢測器(美國Waters公司)。

1.2試藥 荷葉對照藥材(批號121322-201805)、荷葉堿對照品(批號111566-201907)、麥芽對照藥材(批號121105-201808)和橙皮苷對照品(批號110721-201818，質量分數為96%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷對照品(批號MUST-19101010，質量分數為98%，成都曼斯特生物技術有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)；乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；氫氧化鉀、碘化鉀(天津科密歐化學試劑有限公司)；水為自制超純去離子水；其他試劑均為分析純。小兒健胃咀嚼片(批號分別為：20001、20002、20003，山東神州制藥有限公司)。

2 方法與結果

2.1TLC鑒別

2.1.1荷葉 分別取3批小兒健胃咀嚼片，研成粉末，稱取4 g，加水40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液用濃氨調節pH值至10～12，加三氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取荷葉對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。取荷葉堿對照品適量，加三氯甲烷溶液制成質量濃度為0.6 mg·mL-1的荷葉堿對照品溶液。取處方量的1/10，按照小兒健胃咀嚼片處方比例制備不含荷葉的陰性樣品，再按照上述供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。按照TLC法進行實驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶0.5)為展開劑，展開7.5 cm，取出，晾干，噴以改良的碘化鉍鉀試液，日光燈下檢視。結果表明，供試品在與荷葉對照藥材和荷葉堿對照品相應的位置上顯相同顏色的斑點，且陰性溶液無干擾。見圖1A。

2.1.2麥芽 分別取3批小兒健胃咀嚼片，研成粉末，稱取8 g，加無水乙醇50 mL，超聲處理40 min，濾過，濾液加500 g·L-1的氫氧化鉀1.5 mL，加熱回流15 min，置于冰浴中冷卻5 min，移至分液漏斗，加水20 mL 洗滌回流所用玻璃儀器，將水液合并置于分液漏斗中，用石油醚(30～60 ℃)振搖提取3 次，每次20 mL，合并石油醚液，揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取麥芽對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。取處方量的1/10，按照小兒健胃咀嚼片處方比例制備不含麥芽的陰性樣品，再按照上述供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。按照TLC法進行實驗，吸取上述溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯(10∶10∶2)為展開劑，展開8.0 cm，晾干，再以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯(10∶10∶1)為展開劑，展開，晾干，噴以體積分數為15%的硝酸乙醇溶液，顯色，晾干，置于紫外光燈365 nm處檢視。結果表明，供試品在與麥芽對照藥材相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性溶液無干擾。見圖1B。

圖1 TLC圖

2.2陳皮藥材中橙皮苷和蕓香柚皮苷的含量測定

2.2.1溶液的制備

2.2.1.1供試品溶液 分別取3批次小兒健胃咀嚼片，研成粉末，精密稱取1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分數為70%的甲醇10 mL，稱定質量，超聲提取30 min(53 kHz，500 W)，放冷，再稱定質量，用體積分數為70%的甲醇補足減失的質量，濾液過0.22 μm濾膜，即得。

2.2.1.2混合對照品溶液 精密稱取橙皮苷、蕓香柚皮苷對照品粉末適量，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，制成2種成分質量濃度分別為203.46、87.00 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.1.3陰性樣品溶液 取處方量的1/10，按照小兒健胃咀嚼片處方比例和制備工藝制備缺陳皮的陰性樣品，再按照2.2.1.1項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.2色譜條件 色譜柱為Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)柱。流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(洗脫程序為0～5 min，15%A～21%A；5～6 min，21%A～45%A；6～11 min，45%A～75%A；11～12 min，75%A～15%A)。流速為0.3 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進樣量為2 μL；檢測波長為283 nm。

2.3方法學考察

2.3.1專屬性實驗 精密吸取2.2.1項下制備的混合對照品溶液、供試品溶液以及缺陳皮的陰性樣品溶液各2 μL，進樣分析。結果表明，在2.2.2項下色譜條件下，供試品溶液中橙皮苷和蕓香柚皮苷與其他組分色譜峰均可達到基線分離(分離度大于1.5)，且陰性供試品溶液無干擾。見圖2。

圖2 UPLC圖

2.3.2線性范圍考察 按照2.2.1.2項下方法制備系列混合對照品溶液，其中橙皮苷的質量濃度分別為10.17、30.52、61.04、91.55、152.60 μg·mL-1，蕓香柚皮苷的質量濃度分別為4.35、13.05、26.10、39.15、65.25 μg·mL-1。分別精密吸取上述系列混合對照品溶液注入超高效液相色譜(UPLC)儀，按照2.2.2項下色譜條件測定，以各成分峰面積為縱坐標(y)、各成分質量濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線，制得橙皮苷和蕓香柚皮苷的回歸方程分別為y1=11 644x1+2 374.6(r1=0.999 9)和y2=8 981.7x2+33 139(r2=0.999 9)，線性范圍分別為10.17～152.60、4.35～65.25 μg·mL-1。

2.3.3精密度實驗 精密吸取2.2.1.2項下制備的混合對照品溶液2 μL，連續進樣6次，按照2.2.2項下色譜條件進樣測定，測得橙皮苷、蕓香柚皮苷峰面積積分的RSD值分別為1.23%、0.89%，表明該儀器精密度良好。

2.3.4重復性實驗 取同一批樣品(批號20003)，按照2.2.1.1項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2.2項下色譜條件進樣測定，測得供試品溶液中橙皮苷和蕓香柚皮苷的平均含量分別為31.52、8.90 μg·mL-1，其RSD值分別為1.65%、1.17%，表明該方法重復性良好。

2.3.5穩定性實驗 取同一批樣品(批號20003)，按照2.2.1.1項下方法制備供試品溶液，在制備后0、2、4、6、8、10、12，16，20、24 h分別進樣，測得供試品中橙皮苷和蕓香柚皮苷峰面積積分的RSD值分別為0.43%、0.94%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.6回收率實驗 精密稱定同一批樣品(批號20003)6份，分別精密加入2.2.1.2項下制備的混合對照品溶液適量，按照2.2.1.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2.2項下色譜條件進樣測定，計算各組分回收率。結果見表1。

表1 回收率實驗結果 (n=6)

2.4含量測定 取3批小兒健胃咀嚼片，按照2.2.1.2項下方法制備供試品溶液，按照2.2.2項下色譜條件進樣分析，計算3批樣品中橙皮苷和蕓香柚皮苷的含量，結果見表2。由表2可知，小兒健胃咀嚼片每1 g含陳皮以蕓香柚皮苷和橙皮苷計，蕓香柚皮苷不得少于0.08 mg，橙皮苷不得少于0.32 mg。

表2 小兒健胃咀嚼片的含量測定結果

3 討論

小兒健胃咀嚼片現行質量標準的含量控制項僅限于橙皮苷的含量測定，不能全面控制中藥復方制劑的質量。本研究首次采用UPLC法同時測定了小兒健胃咀嚼片中橙皮苷和蕓香柚皮苷的含量，該方法檢測速度快，僅需要12 min即可完成檢測、資源消耗小(3.6 mL流動相即可)，測定結果準確、重復性好，可為提高小兒健胃咀嚼片質量標準的研究提供參考。

3.1TLC鑒別藥材的選擇 小兒健胃咀嚼片現行質量標準中對北沙參、荷葉和白芍進行TLC鑒別，在此基礎上，前期分別進行了山楂、牡丹皮、麥冬、玉竹、荷葉、麥芽和山藥的TLC 鑒別預實驗研究。結果發現，山楂、麥冬、玉竹和山藥的陰性樣品溶液均有較大干擾，因此不能通過調整供試品制備方法、展開劑和顯色劑等予以排除；并且研究發現，麥冬和玉竹的陰性樣品溶液互相干擾，經查閱文獻可知，玉竹藥材和麥冬藥材均屬于百合科，主要化學成分類型極為相似，均屬甾體皂苷類[13-15]；在荷葉TLC鑒別中，增加荷葉堿對照品作為對照(而原標準僅采用荷葉對照藥材作為對照)，可更加全面地控制荷葉藥材的質量。實驗結果顯示，麥芽和荷葉斑點顯色清晰、分離效果好，陰性樣品溶液無干擾，故增加麥芽和荷葉TLC鑒別用于小兒健胃咀嚼片的質量控制。

3.2提取溶劑的選擇 分別采用純水、體積分數為50%的甲醇、體積分數為70%的甲醇作為提取溶劑，研究不同提取溶劑對樣品中各待測組分溶出的影響，結果表明，以體積分數為70%的甲醇作為提取溶劑時，2種待測成分能同時出峰，且含量較高。

3.3提取方法的選擇 分別考察了2種提取方法，即分別用體積分數為70%的甲醇超聲提取30 min與加熱回流提取1 h，測定待測組分峰面積。結果表明，超聲提取較加熱回流提取待測組分含量低，但超聲提取法操作簡單，節約時間，綜合考慮最終選用超聲提取法。

3.4液料比及提取時間的選擇 分別考察了3、6、10、15、20倍提取液料比，結果表明，液料比為10、15倍時，樣品中待測成分含量基本相同，因此，選定提取液料比為10倍。進一步實驗確定提取時間(30、45、60 min)對樣品中各待測成分溶出的影響，結果表明，各成分在提取30、45、60 min時結果基本相同，隨著提取時間的延長，各成分含量變化不大，樣品在提取30 min后各組分已基本全部被提取[16]。因此，最終選擇10倍量體積分數為70%的甲醇超聲提取30 min為小兒健胃咀嚼片的最佳提取方法。

3.5檢測波長的選擇 將小兒健胃咀嚼片樣品溶液用PDA檢測器在210～400 nm范圍內做全波長掃描，得到橙皮苷、蕓香柚皮苷在283 nm波長處有最大吸收[17]。在此基礎上，綜合考慮檢測時各色譜峰的響應值要求，最終選擇283 nm作為檢測波長。

中藥復方藥味多，成分復雜[18]，難以找到有效的方法測定其有效成分，導致中藥的發展始終滯后。近年來，眾多研究者紛紛開展中藥有效成分分析方法的研究，現已成為中藥研究領域的熱點[19-21]。本研究采用UPLC法對中藥復方小兒健胃咀嚼片建立2種有效成分的含量測定，也確定了含量限度。但由于本次研究樣品量較少，后期還需進一步對多個批次樣品進行含量測定研究，從而保證含量限度的合理性。

綜上所述，本研究成功建立了小兒健胃咀嚼片中麥芽、荷葉藥材的定性鑒別方法和陳皮中蕓香柚皮苷、橙皮苷的含量測定方法，均可用于小兒健胃咀嚼片的質量控制。