提高益氣養血口服液質量標準的研究

李 嬋，楊飛快，薛美玲

(1.陜西省藥品和疫苗檢查中心，西安 710065； 2.金花企業(集團)股份有限公司西安金花制藥廠，西安 710065)

益氣養血口服液是由人參、黃芪、淫羊藿、麥冬、陳皮及當歸等13味中藥制成的復方制劑，具有益氣養血的功效，臨床主治氣血不足所致的氣短心悸、面色不華、體虛乏力。該產品在全國共有24個批準文號，生產企業較多，產品質量差異較大。益氣養血口服液的質量標準現執行的是《中國藥典》2020年版[1]，其僅對黃芪甲苷和陳皮進行定性鑒別，對淫羊藿藥材中的淫羊藿苷進行定量控制。本研究在《中國藥典》現行標準的基礎上，參考文獻方法[2-6]，優化了黃芪的薄層色譜(TLC)鑒別，增加了麥冬的定性鑒別，在原淫羊藿苷含量測定的基礎上，增加了朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C，采用一測多評法對4種成分的含量進行測定，為益氣養血口服液生產企業在生產過程中實施有效地監督控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 U3000型高效液相色譜儀，UV/DAD檢測器，變色龍7工作站，均購自戴安(中國)有限公司；BP211D型電子天平(德國賽多利斯集團)；AS3120型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2試藥 黃芪甲苷對照品(批號110781-201717，供含量測定用)，麥冬對照藥材(批號121013-201711，供鑒別用)，淫羊藿苷對照品(批號110737-201516，供含量測定用)，均購自中國食品藥品檢定研究院；朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ對照品，均購自北京北納創聯生物技術研究院；水為超純水，自制；甲醇、乙腈為色譜純，均購自Sigma公司；D101型大孔吸附樹脂(西安藍曉科技新材料科技有限公司)；其余試劑均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。益氣養血口服液：通藥制藥集團股份有限公司(批號191028)，石家莊北方藥業集團有限公司(批號191210)，江蘇聚榮集團有限公司(批號19081901)，通化萬通藥業股份有限公司(批號191103)，四平正和制藥有限公司(批號191028)，金花企業(集團)股份有限公司西安金花制藥廠(批號20201201)。黃芪、麥冬等藥材購自陜西興盛德藥業有限公司，經西安市食品藥品檢驗所謝志民主任藥師鑒定為正品。

2 TLC鑒別

2.1黃芪 取本品20 mL，用水飽和的正丁醇(過夜)振搖提取3次，每次25 mL，合并3次正丁醇液，分別用20、20、15 mL氨試液洗滌3次，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加入稀乙醇1 mL使之溶解，置于中性氧化鋁柱(100～120目，3 g，內徑為1.5 cm)上，加體積分數為40%的乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水1 mL使溶解，過D101大孔吸附樹脂柱(內徑為2.1 cm，柱高為12 cm)，分別加水30 mL、體積分數為40%的乙醇50 mL洗脫，棄去洗脫液，用體積分數為70%的乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，加甲醇1 mL，使殘渣溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成質量濃度為0.5 mg·mL-1的對照品溶液；取上述供試品溶液、對照品溶液各5 μL，點于同一硅膠G板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)，10 ℃以下放置過夜，取下層溶液展開，取出，晾干，噴以體積分數為10%的硫酸乙醇，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，日光下顯相同的淡紫紅色斑點；紫外光365 nm處顯相同顏色的熒光斑點。

2.2麥冬 取本品20 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，再加濃鹽酸(質量分數為37%)2.5 mL，置于沸水浴上回流1 h，放冷，用二氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并二氯甲烷溶液，蒸干，殘渣加二氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取麥冬對照藥材1 g，加水50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至10 mL，再加濃鹽酸(質量分數為37%)2.5 mL，置于沸水浴上回流1 h，同法制得對照藥材溶液。取上述供試品溶液、對照藥材溶液各5 μL，點于同一硅膠G板上，展開劑為二氯甲烷-丙酮(4∶1)，展開，取出，噴以體積分數為10%的硫酸乙醇，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視，供試品色譜中，在與麥冬對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的紫黑色斑點。

3 含量測定

3.1淫羊藿苷

3.1.1色譜條件 Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.5 mL· L-1磷酸溶液(26∶74)；檢測波長：270 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

3.1.2對照品溶液的制備

3.1.2.1淫羊藿苷對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品10.19 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.1.2.2混合對照品溶液的制備 分別精密稱取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品10.44、10.11、10.07、10.58 mg，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.1.3供試品溶液的制備 取6個不同生產廠家的益氣養血口服液，分別精密量取3 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，取上清液，濾過，取續濾液，即得。

3.1.4陰性樣品溶液 按照益氣養血口服液的工藝處方制備不含淫羊藿的陰性樣品，再按照3.1.3項下方法制備陰性樣品溶液。

3.1.5系統適用性考察 分別取3.1.2.1項下制備的淫羊藿苷對照品溶液、3.1.3項下制備的供試品溶液和3.1.4項下制備的陰性樣品溶液，按照3.1.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。結果表明，在該色譜條件下，淫羊藿苷及相鄰色譜峰均可達到基線分離，各峰之間分離度均大于1.5，淫羊藿苷的理論塔板數按照淫羊藿苷峰計算應不低于2 500，陰性樣品無干擾。

3.1.6淫羊藿苷含量測定結果 取市售6個不同廠家生產的益氣養血口服液，按照含量測定項下方法進行測定，現行標準要求本品每1 mL含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H46O15)計，不得少于0.12 mg；由表1可知，6批樣品中淫羊藿苷的含量測定結果均符合規定，結果見表1。

表1 不同生產企業益氣養血口服液中淫羊藿苷的含量測定結果 (n=2)

3.1.7供試品溶液色譜圖分析 在供試品溶液色譜圖中，淫羊藿苷色譜峰峰形較好，與其相鄰色譜峰的分離度高。此外，該色譜圖中有多個峰形好、分離度高的色譜峰，經對處方進行分析，并采用對照品進行定位可知，分別為朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷。結果見圖1。

圖1 HPLC圖

3.2朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量測定結果

3.2.1外標法

3.2.1.1混合對照品溶液 取3.1.2.2項下制備的混合對照品溶液。

3.2.1.2樣品測定結果 取6個不同廠家生產的益氣養血口服液，按照3.1.3項下供試品溶液方法進行制備，以混合對照溶液中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C為對照，按照外標法進行計算，樣品中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量測定結果見表2。

3.2.2一測多評法

3.2.2.1相對校正因子 一測多評法[7-14]測定益氣養血口服液中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量，相對校正因子的測定方法采用標準曲線法，色譜條件及樣品處理同3.1項下，以淫羊藿苷為內參物，測得朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的相對校正因子分別為0.826、0.831、0.874。

3.2.2.2樣品測定結果 采用相對校正因子計算樣品中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量，結果見表2。

3.2.32種方法的結果對比 采用淫羊藿苷單對照一測多評法及多對照外標法[15-16]測定6個不同廠家生產的益氣養血口服液中淫羊藿類成分的含量，結果見表2。由表2可知，采用淫羊藿苷單對照一測多評法的測定結果與外標法多對照測定結果基本一致；考慮到朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C對照品價格昂貴且不易購買，因此采用淫羊藿苷單對照一測多評法，其檢測效率高，檢驗成本顯著降低。

表2 淫羊藿類成分含量測定結果 (n=2)

4 討論

目前市場上淫羊藿藥材質量差異較大[17-19]，直接影響成品制劑的治療效果。現行標準中僅測定淫羊藿苷單一成分含量對制劑進行控制，且淫羊藿苷含量限度僅為不低于0.12 mg·mL-1，不能較好地反映成品制劑的質量。

本研究發現，供試品溶液色譜圖中，淫羊藿苷前后有多個色譜峰，且峰形較好、分離度高，因此對處方進行分析，并通過對照品定位進行排查，在現有淫羊藿苷含量測定的色譜條件下，對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、陳皮中橙皮苷、淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ進行定位及篩選，供試品色譜中，最終選擇分離度好、峰面積較大的朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C進行研究[20]。

本研究依據《中國藥典》2020年版中益氣養血口服液質量標準，在不改變淫羊藿苷含量測定色譜條件的基礎上，采用一測多評法以價廉的淫羊藿苷為內參物，對供試品中多種成分含量進行測定，避免了外標法需要采用多種對照品才能進行檢測的弊端，解決了部分對照品不易采購、企業檢測成本高等問題，克服了不同色譜系統操作繁瑣、檢測周期長的缺點，可同時實現中藥制劑產品多組分內代表性成分的快速檢測，因此可供各生產企業用于益氣養血口服液中多種成分的檢測與監控[4,6，20]。

原檢驗方法中供試品取樣量為10 mL，用5 mL水飽和的正丁醇萃取，用氨試液洗滌后，需要通過中性氧化鋁、D101大孔吸附樹脂，操作過程復雜，程序較多，不易檢出黃芪甲苷。本研究優化了黃芪甲苷的TLC法，保證了一次檢出成功率；同時在原鑒別的基礎上增加了麥冬的TLC法鑒別，提高了其質量標準。