長春西汀注射劑及其原料和輔料中15種微量元素的測定

陳小英，薛曉文，妙 苗，王嫦鶴，劉海靜*

(1.陜西中醫藥大學，咸陽 712046；2.陜西省食品藥品檢驗研究院，西安 710065)

長春西汀是從夾竹桃科植物小蔓長春花中提取分離的生物堿長春胺并對其結構進行改造得到的衍生物[1-3]。長春西汀是吲哚類生物堿[4-5]，脂溶性好，易通過血腦屏障[6]，可增加腦血流量，促進腦內單胺代謝的轉換，改善血液流動性和修復腦損傷。臨床上常用于改善腦梗死后遺癥[7]、腦動脈硬化癥、腦出血后遺癥、慢性腦缺血[8]、中風后遺癥[9-10]以及認知能力等[11-12]，其療效好、耐受性好，被廣泛應用于臨床治療中[13]。

微量元素是指占生物體總質量0.01%以下的元素，如鐵(Fe)、銅(Cu)、碘(I)、溴(Br)、硅(Si)、錳(Mn)等。人體中存在的微量元素總量極低，每日對微量元素的需求量很少，微量元素攝入過量會不同程度地引起人體生理異常，并對身體造成較大的危害。微量元素的種類不僅包括對人體生命活動不可或缺的微量元素，還包含對人體有害的微量元素和重金屬。有害微量元素會對人體產生致癌、致畸作用，比如鉛(Pb)、鋁(Al)、砷(As)、汞(Hg)、鎘(Cd)等。重金屬是指密度大于5 g·cm-3的金屬，對人體有害的重金屬主要包括Cd、Hg、Pb、鎳(Ni)等[14]。重金屬極易從原料輔料、生產工藝和藥品包材等引入藥品中[15]。重金屬元素及有害元素可能會引起身體各部位的病變，包括消化系統、神經系統、血液系統等，可能引起腸胃損傷、腎功能衰竭、中樞麻痹等病理現象[16]，甚至致癌，是影響注射劑安全性的一項重要考察因素，因此有必要將微量元素種類及含量(尤其是重金屬及有害元素含量)作為注射劑質量標準的重要指標之一。國內外的藥品標準中對微量元素的種類及限度有相應的規定。

重金屬元素及有害元素常用的檢測方法有原子吸收分光光度法[17]、原子熒光分光光度法[18]、電感耦合等離子體法[19]。電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)是將電感耦合等離子體與質譜聯用，利用電感耦合等離子體使樣品離子化，將待測金屬分離出來，從而進入質譜測定，可進行同位素分析，該方法靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬，廣泛用于檢測痕量元素[20-21]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Thermo ICAPRQ型電感耦合等離子體質譜儀(賽默飛世爾科技公司)；ME204型電子分析天平(萬分之一，梅特勒-托利多公司)；G-400型智能控溫電加熱器(上海屹堯儀器科技發展有限公司)；MULT MAVE 3000型微波消解儀(安東帕(上海)商貿有限公司)；TTL-10B型超純水系統(北京同泰聯科技公司)。

1.2試藥

1.2.1供試品 包括長春西汀注射劑、 長春西汀原料和輔料(L-酒石酸、焦亞硫酸鈉、山梨醇、維生素C和甘露醇)。

1.2.1.1長春西汀注射劑 A 企業，批號191108；B企業，批號分別為：1901241、1904274、1805152、1904273、1901212、1901262、1712012、1811281、1904252、1611102、1707142、1805144、1701121、1901231、1904263、1901261、1909232、1909231、1704142、1604221、1901212、1904242、1901262、1711302、1901211、1812202、1901261、1901262、1904262、1909251；C企業，批號分別為 11904042、11812102、11812031、11908152、11812122、11908151、11812122、11904041、11807171、11901281、11904032、11908161、11812102；D 企業，批號分別為：200201A、181202A、190303A、2002205A、2002204A、2002202A、190301A、190104A、200201A、180506A、190106A；E 企業，批號分別為： 1910121、1904038、1912127、1912131、1905066、1911124、1912134、1910112、1912135、2004024、2004025、1912142、2001009；F企業，批號分別為：21911011、11911014、11904021、1200102、1200101、21911014；G企業，批號分別為：190713、31190203、190713、190710、31190310、31190205、190709、190712、190703、190701、190912、190913、190914、190915、190124；H企業，批號：190214；I 企業，批號分別為：DB190205、DB190101、DB190201、DB190201、20180601、20171201；J企業，批號分別為： 1911012、1905192、1905202、1905222、19092721、19111821、19121521、19100821、19120721、20010221、19121721、1906181、1811071、1804201、1809121、1906141、1811061、1903211、1811021、1904171、1903201、1906181、1905091、1906121、1906131、1811031；K企業，批號分別為：11190502、11181107、9190701、9190702、9190601、9190301、11190506、9190302、11190502； L 企業，批號分別為：1911025、1911024；M企業，批號分別為： 20190201、20190303、20190301；N 企業，批號分別為：1902211、1902201、1902161、1902171、1902181、1903171、1903181、1903191、1902191；O企業，批號分別為： 19022707、19080706、19022706； Q企業，批號分別為： A92055A、A84067A、A94129A、A92056A；R企業，批號分別為： D190263、D190924、D191091、D191083；S 企業，批號分別為：30619004、30619005； T企業，批號分別為： P1/20190901、P1/20190901；U企業，批號分別為 190701、190101。

1.2.1.2長春西汀原料 長春西汀原料分別來源于A企業、B企業、D企業、G企業、I企業、J企業、K企業、M企業、N企業、O企業、P企業、Q企業、R企業、S企業、T企業。

1.2.1.3輔料 L-酒石酸分別來源于B企業、J企業、P企業、Q企業；焦亞硫酸鈉分別來源于 B企業、J企業、P企業、Q企業；山梨醇分別來源于B企業、J企業、Q企業；維生素C分別來源于 B企業、J企業、Q企業；甘露醇來源于J企業。

1.2.2對照品 ICP分析用多元素對照品溶液[Al、As、硼(B)、鈹(Be)、鈣(Ca)、Cd、鈷(Co)、鉻(Cr)、Cu、Fe、Hg、鉀(K)、鎂(Mg)、Mn、鉬(Mo)、鈉(Na)、Ni、Pb、銻(Sb)、硒(Se)、鈦(Ti)、釩(V)、鋅(Zn)](100 μg·mL-1，批號GNM-M25748-2013)，鈀(Pd)單元素對照品溶液(1 000 μg·mL-1，批號GSB 04-1743-2004)，鉍(Bi)、鍺(Ge)、銦(In)、鋰(Li)、錸(Re)、銠(Rh)、鈧(Sc)、釔(Y)多元素對照溶液(100 μg·mL-1，批號GNM-M081395-2013)，均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸(色譜純，德國默克公司)；水為高純水。

2 方法與結果

2.1實驗條件 射頻功率：1 549 W；等離子氣流量：14 L·min-1；輔助氣流量：1.08 L·min-1；泵速：40 r·min-1；進樣延遲時間：30 s；氧化物：CeO/Ce<0.02；雙電荷：Ce++/Ce+<0.02；樣品重復次數：3次；測量模式：動能歧視(KED)模式。

2.2溶液的制備

2.2.1多元素對照品溶液和Pd對照品溶液 多元素對照品溶液：精密量取ICP分析用多元素(質量濃度均為100 μg·mL-1)的對照品溶液(Al、As、B、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Hg、K、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、Pb、Sb、Se、Ti、V、Zn)適量，用50 mL·L-1硝酸溶液定量稀釋，并制成含各元素質量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 ng·mL-1的溶液，作為多元素對照品溶液。Pd對照品溶液：精密量取的Pd單元素對照品溶液質量濃度為1 000 μg·mL-1的適量，用50 mL·L-1硝酸溶液定量稀釋，制成含Pd元素質量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 ng·mL-1的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2內標溶液 精密量取Bi、Ge、In、Li、Re、Rh、Sc、Y多元素對照品溶液適量，用50 mL·L-1硝酸稀釋成質量濃度為20 ng·mL-1的溶液。選擇其中的Bi、Ge、In元素作為本次實驗的內標元素。

2.2.3供試品溶液及空白溶液 精密稱取長春西汀原料藥0.25 g，加硝酸5 mL，置于90 ℃電熱板上，加熱1 h，放冷，置于消解儀中消解，消解程序見表1。消解完畢后冷卻至室溫，轉移至50 mL離心管中，用少量高純水洗滌消解罐3次，合并洗液，用高純水定容至50 mL，搖勻，以12 000 r·min-1離心10 min，經0.22 μm微孔濾膜過濾,即得長春西汀原料供試品溶液。同法制備空白溶液。

表1 微波消解程序

精密稱取輔料0.1 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇1 mL使其溶解，用50 mL·L-1的硝酸稀釋至刻度，搖勻，作為長春西汀原料供試品溶液。同法制備空白溶液。

取長春西汀注射劑1支，置于10 mL量瓶中，用50 mL·L-1的硝酸稀釋至刻度，搖勻，作為長春西汀注射劑供試品溶液。同法制備空白溶液。

2.3方法學考察

2.3.1線性關系考察 取2.2.1項下制備的多元素對照品溶液和Pd對照品溶液，按照2.1項下實驗條件進行測定，以各元素測量值與內標測量值的比值(y)為縱坐標、相應檢測質量濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線，得到各元素的線性方程和相關系數。結果見表2和表3。結果表明，各元素的質量濃度在1.0～20.0 ng·mL-1范圍內與其測量值呈良好的線性關系。

2.3.2檢測限 取空白溶液連續測定10次，按照2.1項下實驗條件進行測定，記錄各元素強度，計算空白溶液10次測定中各元素質量濃度的標準偏差，以3倍標準偏差為檢測限。結果見表2和表3。

2.3.3精密度、重復性實驗 取多元素對照品溶液(10 ng·mL-1)和Pd對照品溶液(10 ng·mL-1)，連續進樣6次，按照2.1項下實驗條件進行測定，結果見表2和表3。結果符合規定，表明儀器精密度良好。取樣品6份，按照2.2.3項下供試品溶液制備方法制得供試品溶液，按照2.1項下實驗條件進樣檢測分析，結果符合規定，表明該方法重復性良好。

2.3.4加樣回收率試驗 分別稱取長春西汀原料、輔料0.25 g，長春西汀制劑(批號191108)1支，分別精密加入多元素對照品溶液和Pd對照品溶液，按照2.2.3項下方法制得供試品溶液，按照2.1項下實驗條件進樣檢測分析，計算得加樣回收率為90.3%～101.6%。結果見表2和表3。

表2 15種元素線性方程、檢測限和加樣回收率(長春西汀注射劑及輔料)

表3 各元素線性方程、檢測限和加樣回收率(長春西汀原料)

2.4樣品含量測定及結果分析

2.4.1樣品含量測定結果 分別精密稱取各樣品適量，按照2.2.3項下供試品溶液制備方法分別制備注射劑樣品溶液，原料及輔料樣品溶液，按照2.1項下實驗條件，測定樣品中Cd、Hg、Pb、As、Co、V、Ni、Pd、Rh、Mo、Cu、Cr、Al、Mn、Fe 15種元素的含量。結果見表4和表5。

表4 長春西汀注射液劑中微量元素每日攝入量結果(排名前3)

表5 長春西汀原料中微量元素每日攝入量結果(排名前3)

2.4.2注射劑微量元素測定結果分析 15種待測元素的國際人用藥品注冊技術協調會(ICH)毒性分類以及每日允許暴露量或允許含量見表6。根據藥品說明書，按長春西汀注射劑最大日劑量為30 mg計算樣品中各微量元素的每日攝入量，結果顯示，所有批次樣品中微量元素每日攝入量均低于“表6微量元素雜質及每日允許暴露量”，但是有部分生產企業樣品中微量元素含量較高。

表6 部分微量元素雜質及每日允許暴露量或允許含量

根據每日攝入量排名前3的制劑樣品中微量元素結果(見表4)，A企業(批號191108)樣品中Cd、Pb含量均較高，特別是Pb為每日允許暴露量的11%?？紤]到長春西汀注射劑在臨床存在的超劑量用藥情況(3～4倍)，而且Pb在人體中較容易蓄積不易排出，注射劑中Pb的風險需要進行考慮。

B企業的Cd、Hg、V含量均較高，特別是批號為1604221的樣品，其Hg、V含量均較高。對藥品生產企業工作人員進行訪談，該藥品生產企業的長春西汀原料來源是企業自制的長春西汀原料和進口原料。2016年生產的樣品其原料多為自制原料，2017年以后多采用進口原料。

D企業As含量較高，其中4批As的每日攝入量為0.48～0.74 μg，約為每日允許暴露量的8.0%～12.4%，考慮到該品種在臨床存在的超劑量用藥情況(3～4倍)，制劑中As的風險需要進行考慮。

C企業的Cd、Hg、Pb、Cr的含量均較高。

此外，雖然該品種的原料在合成過程中用到了金屬催化劑Pd，但是此次所有批次樣品中Pd的殘留遠低于每日允許暴露量。此外重金屬Rh和Mo均較低，均遠低于每日允許暴露量。

2.4.3原料和輔料微量元素測定結果分析 對15個生產企業的長春西汀原料藥進行ICP-MS測定，對其數據進行分析，表5是每日攝入量排名前3的長春西汀原料藥中微量元素結果，其中N企業原料中的Pb為6.179 2 μg·d-1，超出了ICH規定的每日允許量(5 μg·d-1)的限度。

分別對4個生產企業的L-酒石酸、焦亞硫酸鈉、山梨醇、維生素C、甘露醇5種輔料進行ICP-MS測定，15種微量元素測定結果均較低，均遠低于每日允許暴露量。

由于企業提供的原料、輔料與抽樣制劑中所用的原料、輔料不一致，其微量元素在原料、輔料和制劑中的相關性無法進行分析，但是部分原料樣品中元素超出限度應引起重視。

2.5風險評估 藥品中微量元素主要來源于原料、輔料、溶劑、生產設備、無機試劑、直接接觸包裝材料等。有些微量元素具有毒性，會影響藥品的安全性，其中重金屬可在人體器官內大量蓄積，導致人體代謝受到破壞，引發人體損傷[22]。所以藥品監管機構對藥品微量元素的控制越來越嚴格。ICH Q3D元素雜質指導原則是比較完整的法規。在ICH Q3D的基礎上，各國藥典對微量元素進行控制，美國藥典(USP)收載了〈232〉元素雜質限度，《中國藥典》2020年版四部通則9102中提到，無機雜質應按照Q3D的要求進行研究，并確定檢查項目[23]。

ICH Q3D元素雜質指導原則是對潛在元素毒性的評估，根據元素毒性及在藥品中出現的可能性，將元素分為3類，并建立了元素允許日暴露量。第1類包括As、Cd、Hg和Pb，這些元素具有明顯的毒性，對人體有害，在藥品生產中禁用或限制使用，因此必須對所有的潛在來源及攝入途徑進行安全性風險評估。第2類根據其出現在藥品的相對可能性，進一步分為2A和2B。2A包括Co、V和Ni，這些元素在自然界較豐富，出現在藥品中的可能性高，需要對所有潛在來源和攝入途徑進行風險評估。2B包括Pd、Rh、Au、TI、Pt、Ir和Os，這些元素在自然界存在較少，出現在藥品中的可能性較低，只有在生產中刻意添加才需要風險評估。第3類包括Mo、Cu、Cr、Ba、Li、Sb、Sn，此類元素只有在藥品生產過程中刻意加入，才需要進行風險評估。藥品中包含的其他元素也會對身體產生損害，如Al導致腎功能損傷和肺纖維化，Mn和Zn導致肝功能損傷等。需要考慮的元素包括Al、Mn、Fe、B、Ca、K、Mg、Na、W和Zn。USP42-NF37通則〈232〉也規定了24種金屬元素雜質的每日允許接觸限值(PDE)，元素種類和限度與ICH Q3D一致。

《中國藥典》[24]2020年版四部通則0102注射劑中重金屬及有害元素殘留量項下僅規定了Pb、Cd、As、Hg和Cu 5種元素的限度，未規定其他有害元素的限度?！吨袊幍洹穂25]2015年版四部增加了除礦物藥或含礦物藥的制劑以外的中藥中Al、Cr、Fe、Ba元素的測定。

通過查閱文獻可知，長春西汀注射液的不良反應主要表現在皮膚、消化系統、呼吸系統、血液系統及造血器官、神經系統、內分泌系統等方面。可引起黃疸、嚴重腹瀉、便秘、發熱、昏迷、休克、喘息、胸悶、白細胞急速減少、頭痛、頭暈、下肢抽搐、致亞急性甲狀腺炎等不良反應[26-27]。

Cd、As、Hg、Pb、Cu等元素在人體內蓄積時，Cd毒性主要造成對血液和神經系統的損害，As的毒性對中樞神經具有損害，可引起惡性、嘔吐、抽搐、昏迷等，Hg的毒性主要破壞中樞神經；Pb的毒性可損害甲狀腺功能，過多的攝入Cu元素可引起黃疸[28-30]。這些元素對人體的不良反應和長春西汀注射劑的不良反應有一定的重合性，又因為長春西汀注射劑是靜脈滴注，直接進入血液，不經過肝臟的首過效應，很少量的元素進入機體都會引起不良反應。

長春西汀注射劑及其原料和輔料雖然檢出多種微量元素，但未超出ICH Q3D元素雜質指南、《中國藥典》四部2020年版及USP42-NF37通則〈232〉的相關規定。近年來微量元素的不良反應已經威脅到臨床用藥安全，其中有害元素對人體有很大的損害，引發相關疾病甚至導致死亡。我國對微量元素的規定不健全，多借鑒國外的標準。ICH Q3D元素雜質指南、《中國藥典》2020年版四部通則0102及USP42-NF37通則〈232〉中的規定是對微量元素最低的要求，但是長春西汀注射劑臨床上多用于病情嚴重的老年病人，注射劑在臨床使用中具有高風險的特點，應該適當地提高微量元素的限度。

參考ICH Q3D元素雜質指南、《中國藥典》2020年版四部通則0102及USP42-NF37通則〈232〉的相關要求，結合樣品實際情況，擬定出12種微量元素的限度。

在所測的元素中，Cd、Hg、Pb、As、Co、Cr、V、Ni、Pd、Rh為有害元素。其中，Pb、As、Hg、Cd在《中國藥典》2020年版四部中有嚴格的限度規定，而Co、Cr、V、Ni、Pd、Rh均未規定。隨著人們生活水平以及認知水平的提高，應完善和增加其他有害元素的限量和限度制定。雖然所有制劑樣品測定結果均符合規定，但是部分藥品生產企業的制劑中Cd、Hg、Pb、V、As和Ni含量較高，應引起重視。

N企業的原料中的Pb為6.18 μg·d-1，超出了ICH規定的每日允許量(5 μg·d-1)的限度。因此，不合格的原料、輔料樣品應引起重視。

3 小結

IPC-MS法操作簡單，檢測結果準確，可用于長春西汀注射劑及原料、輔料中15種微量元素的檢測。參考ICH Q3D元素雜質指南、《中國藥典》2020年版四部通則0102及USP42-NF37通則〈232〉的相關要求，本研究擬定了其中12種微量元素的限度，確保長春西汀注射劑臨床用藥的安全。