Boc5對腦缺血再灌注小鼠血腦屏障損傷的保護作用

李紀宏，劉晨旭，馮穎達，孫 陽，李小強，張慧楠

(1.空軍軍醫大學藥學系藥理學教研室，西安 710032；2.國家中醫藥管理局中藥胃腸藥理重點研究室，西安 710032)

腦卒中是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病[1-2]。尋找并開發新的具有神經保護作用的藥物對于減輕腦缺血再灌注損傷(CIRI)具有重要的臨床意義[3-4]。星形膠質細胞是腦中數量最多的細胞，通過藥物干預減輕星形膠質細胞炎癥釋放是改善CIRI預后的有效治療策略[5-7]。

胰高血糖素樣1受體(GLP-1R)屬于G蛋白偶聯受體，在心臟、腎臟、肝臟和腦等重要器官中均有表達[8-9]。腦內GLP-1R激動能夠抑制神經細胞凋亡，減輕炎癥損傷[10-11]。目前在臨床上應用的GLP-1R激動劑均只能注射給藥[12]。Boc5 (C54H52N4O16S2)是通過高通量篩選的方法在48 600個小分子化合物庫中篩選得到的具有口服活性的GLP-1R小分子激動劑[13]。既往實驗結果表明，Boc5能夠通過激活GLP-1R降低血糖[14-15]，但其對CIRI的保護作用目前尚無報道，本研究通過小鼠大腦中動脈栓塞再灌注(MCAO/R)模型探討其作用及機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 SZM45型體式顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；HC-X803型顯微精細鑷，寧波市成和顯微器械廠；紫外分光光度計，美國Bio-Rad公司；FV1000型激光掃描共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司；Tanon-4200型化學發光成像分析系統，上海天能科技有限公司。

1.2試藥 Boc5，美國TargetMol Boston公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，美國Sigma公司；多聚甲醛溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)，均購自北京里根生物技術有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和過氧化氫酶(CAT)試劑盒，均購自南京建成科技有限公司；抗閉合蛋白、緊密連接蛋白-5單克隆抗體、二抗，均購自美國Cell Signaling Technology公司；TUNEL染色試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司。

1.3實驗動物 成年雄性C57BL/6J小鼠，體質量為18～22 g，購自空軍軍醫大學動物中心。在溫度為25±2 ℃、相對濕度為50%～70%的條件下飼養，12 h明暗交替。

2 方法

2.1MCAO/R模型的建立 參照文獻方法[16]。將C57BL/6J小鼠用10 mg·mL-1戊巴比妥鈉麻醉，沿頸部正中剪開皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，分離出頸總、頸外和頸內動脈，栓線自頸內動脈穿入，經頸總動脈栓塞大腦中動脈，60 min后拔出栓線模擬再灌注過程。

2.2動物分組及處理 將75只C57BL/6J小鼠隨機分為假手術組、模型組和Boc5高、中、低劑量(10.0、5.0、2.5 μmol·kg-1)組，每組15只。Boc5高、中、低劑量組連續灌胃給藥7 d后行MCAO/R損傷；模型組給予等體積的生理鹽水7 d后行MCAO/R損傷。

2.3神經功能缺陷評分 MCAO/R損傷24 h后，分別在各組小鼠中隨機取8只，按照改良神經功能損害評分法(mNSS)評價神經功能損傷情況[17-18]，其中提尾實驗3分，行為功能評分3分，感覺實驗評分2分，平衡木實驗6分，反射評分4分，總分為18分，總分越高，表示行為缺陷越嚴重。

2.4足誤實驗及轉棒實驗 神經功能缺陷評分后隨即進行足誤實驗及轉棒實驗[19-20]。足誤實驗旨在評價左前肢功能，將小鼠放在帶網格的格子架上(長×寬×高：40 cm×20 cm×30 cm)，計數小鼠左前爪錯誤次數和右前爪總步數；轉棒實驗旨在評價運動協調能力。MCAO/R損傷前每日對各組小鼠進行1次訓練，共3 d，MCAO/R損傷測定小鼠轉棒停留時間。

2.5生化指標檢測 MCAO/R損傷24 h后，分別在各組小鼠中取6只，眼眶取血，分離血清，按照試劑盒說明書檢測SOD、MDA和CAT水平。

2.6TTC染色 各組分別取5只小鼠，處死，取腦，用TTC染色法計算梗死面積[21]。將腦組織置于-20 ℃環境下冷凍0.5 h，冠狀切面(2 mm·片-1)；將腦片置于TTC溶液(20 mg·mL-1)中，37 ℃孵育0.5 h，不斷翻動腦片，確保染色均勻；多聚甲醛(40 mg·mL-1)固定12 h，拍照，用Photoshop計算梗死面積百分比。

2.7原代星形膠質細胞的培養 參照文獻方法[22]，取新生1 d的幼鼠，酒精浸泡消毒后置于冰浴D-Hank′s平衡液的滅菌皿中，精細鑷取全腦置于另一滅菌皿中；剝離軟腦膜，夾碎皮層；加入10 mg·mL-1胰蛋白酶1.5 mL，置于37 ℃恒溫培養箱中消化30 min；離心管中將細胞吹打至混懸；200目篩網過濾；置于37 ℃培養箱中培養14 d，每3 d換液1次。

2.8氧糖剝奪損傷/復氧 (OGD/R) 損傷 參考文獻方法[23]，用PBS沖洗細胞3次，置于無糖DMEM培養基中培養，并在無氧氣體(94%氮氣+6%二氧化碳)的密閉室內培養6 h；損傷6 h后換回含血清DMEM培養基[24]，置于正常氧環境中培養24 h。

2.9血腦屏障通透性測定 伊文氏藍法檢測血腦屏障通透性[25-26]。MCAO/R后，分別在各組中取4只小鼠，尾靜脈注射20 mg·kg-1伊文氏藍，2 h后過量麻醉處死小鼠，取缺血側腦組織稱定質量后置于EP管中，加入甲酰胺3.0 mL，55 ℃避光孵育24 h，用紫外分光光度計在630 nm波長處檢測吸光度值A，結果表示為A·g-1濕腦組織。

2.10酶聯免疫吸附 (ELISA) 法檢測炎性因子水平 采用試劑盒檢測炎性因子白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6 (IL-6)的水平。取星形膠質細胞培養液的上清液，4 ℃條件下以1 000 r·min-1離心5 min；加入到包被抗小鼠IL-1β、TNF-α和IL-6單抗的酶標板上；每孔分別加入酶標抗體液100 μL，混勻后置于37 ℃孵箱內孵育1 h；洗滌酶標板，甩干水分；每孔再分別加底物工作液100 μL，置于37 ℃孵箱中避光反應10 min，顯色；每孔各加入50 μL終止液終止反應；置于酶標儀上測定各孔在490 nm波長處的吸光度值A。

2.11Western Blot實驗 MCAO/R后，分別在各組中取4只小鼠過量麻醉處死小鼠，取缺血半暗區組織，加入100 μL蛋白裂解液，冰上超聲，以13 000 r·min-1離心15 min，取上清液；蛋白質定量(BCA)法測定蛋白濃度；加上樣緩沖液40 μg，煮沸5 min，電泳分離、轉膜，以0.05 g·mL-1脫脂奶粉封閉60 min，加一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育12 h，TBST洗滌3次，加二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育60 min，用TBST洗滌3次，ECL顯色，Bio Rad凝膠成像系統拍照，Quantity One軟件對Western Blot條帶進行灰度分析。

2.12統計學方法 2組間比較采用Student'st檢驗；多組間比較先進行方差分析后進行Dunnettt檢驗；P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1Boc5對MCAO/R所致小鼠行為缺陷的影響 見表1。由表1可知，與模型組比較，Boc5中、高劑量組神經缺陷評分和足誤率顯著改善，轉棒停留時間明顯延長。實驗結果表明，Boc5能改善MCAO/R所致的小鼠行為學損傷。

表1 Boc5對MCAO/R所致小鼠行為缺陷的影響

3.2Boc5對MCAO/R后生化指標的影響 見表2。由表2可知，與模型組比較，Boc5低、中、高劑量組SOD、MDA和CAT水平均顯著改善。

表2 Boc5對MCAO/R后血液生化指標的影響

3.3Boc5對MCAO/R損傷后腦梗死面積的影響 由于Boc5中劑量組小鼠在行為學實驗中即表現出顯著的行為缺陷，故選取Boc5中劑量組給藥開展后續實驗。見表3和圖1。由表3和圖1可知，MCAO/R損傷后小鼠腦區出現大面積梗死(白色)；與模型組比較，Boc5 中劑量組能顯著減小小鼠腦梗死面積。

圖1 Boc5對MCAO/R損傷后腦梗死面積的影響

表3 Boc5對MCAO/R損傷后腦梗死面積的影響

3.4Boc5對MCAO/R致血腦屏障損傷的影響 見表4和圖2。由表4可知，模型組血腦屏障通透性明顯增加，與模型組相比，Boc5中劑量組血腦屏障通透性顯著降低。由圖2可知，模型組缺血半暗區閉合蛋白、緊密連接蛋白-5表達顯著降低，而Boc5中劑量組則顯著增加閉合蛋白、緊密連接蛋白-5表達水平。實驗結果表明，Boc5可顯著減輕MCAO/R所致的血腦屏障損傷。

圖2 Western Blot結果

表4 Boc5對MCAO/R致血腦屏障損傷的影響

3.5Boc5對MCAO/R損傷后星形膠質細胞增殖及活化的影響 見圖3和表5。由圖3和表5可知，MCAO/R損傷24 h后，模型組缺血半暗區內膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性細胞數量顯著增加，而Boc5中劑量組GFAP陽性細胞數量顯著減少。表明Boc5能夠改善MCAO/R損傷后星形膠質細胞增殖及活化。

圖3 Boc5對MCAO/R損傷后星形膠質細胞增殖及活化的影響

表5 Boc5對MCAO/R損傷后GFAP陽性細胞數量的影響

3.6Boc5降低OGD/R損傷后星形膠質細胞炎性因子水平 CIRI后星形膠質細胞的增生和活化產生的炎性因子是導致血腦屏障破壞的重要原因。體外培養星形膠質細胞，ELISA法檢測OGD/R損傷后炎性因子水平，評價Boc5對星形膠質細胞所致炎癥反應的影響。ELISA實驗結果表明，氧糖剝奪損傷(OGD) 6 h，復氧24 h后，IL-1β、TNF-α和IL-6水平顯著增加，而Boc5可顯著降低IL-1β、TNF-α和IL-6炎性因子水平，見表6。

表6 Boc5對星形膠質細胞OGD/R損傷后炎性因子水平的影響

4 討論

缺血性腦卒中嚴重影響人類生命健康，尋找切實有效的防治靶點是科學家研究的熱點[27-28]。既往研究表明，GLP-1R激動劑exendin-4、liraglutide和pro-GLP-1等能有效減輕腦缺血面積、改善行為缺陷、減少神經元細胞死亡和減輕炎性反應，表明GLP-1R激動劑能成為防治CIRI的有效藥物[29]。目前，已有GLP-1R激動劑艾塞那肽、利拉魯肽批準上市，然而這些藥物均為多肽類藥物，存在不能口服給藥的缺點。近年來，相繼發現了一些具有口服活性的小分子GLP-1R激動劑[30]，其中Boc5具有安全性高、半衰期長和能夠透過血腦屏障的優點，具有較好的成藥性，本研究所采用劑量為前期實驗報道的安全劑量。本研究進一步發現，Boc5口服給藥后能夠顯著減輕MCAO/R所致的損傷。以上研究表明，Boc5可能成為具有口服吸收活性的防治CIRI的有效藥物。

星形膠質細胞產生的炎性因子是加重CIRI后血腦屏障損傷的重要誘因。本實驗結果表明，Boc5能降低星形膠質細胞OGD/R釋放的炎性因子水平。據此推測，Boc5的作用機制可能是通過激活星形膠質細胞GLP-1R，通過減少炎性因子釋放減輕CIRI后血腦屏障損傷，最終改善CIRI，其確切機制還需進一步實驗證實。