氧化槐果堿對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

張 偉，王 彤，余建強，王曉琴，康艷生，常人元，劉靜靜*

(1.榆林市第一醫院藥劑科，榆林 719000；2.寧夏醫科大學藥學院，銀川 750004)

酒精性肝病(ALD)是臨床常見的一種因長期和/或大量飲酒所致的肝病，已成為除病毒性肝炎所致肝損傷以外的第二大常見肝病[1]。酒精攝入機體后90%以上在肝臟代謝，少量直接通過肺、尿液和汗液排出體外，其在肝臟代謝過程中會產生大量活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基，當酒精攝入量超過肝臟的清除能力后，便會引起肝臟的氧化應激損傷，進一步導致酒精脂肪肝、肝炎、肝硬化，甚至肝癌[2]。氧化槐果堿(OSC)是從天然藥物苦豆子中提取的藥代動力學符合二房室模型的一種生物堿[3]。研究表明，OSC具有鎮痛[4-5]、抗炎[6-8]、抗肺損傷[9]、抗腫瘤[10-11]、抗驚厥[12-13]、抗腦缺血/再灌注損傷[14-15]等多種藥理作用，其肺損傷保護作用和神經保護作用皆與OSC抗氧化應激、炎癥反應以及抗凋亡等機制有關。本研究旨在通過建立急性酒精性肝損傷小鼠模型，觀察OSC對模型小鼠的肝功能指標、抗氧化指標以及肝臟組織結構的影響，探討OSC對酒精誘導的急性肝損傷是否具有保護作用及其潛在的機制，為尋找保肝新藥提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 低溫冰箱(-20 ℃，合肥榮事達電冰箱有限公司)；超低溫冰箱(-80 ℃，日本三洋電器股份有限公司)；DK-600型電熱恒溫水浴箱(上海佳勝實驗設備有限公司)；752型紫外分光光度儀(上海精密科學儀器廠)；超聲波細胞破碎機(南京貝帝實驗儀器有限公司)；FM70型制冰機(美國Grant公司)；WH-861型旋渦混勻器(太倉市科教器材廠)；METTLER TOLED型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；pH計(德國Beckman公司)；Olympus CHC-212光學顯微鏡(日本)奧林巴斯株式會社。

1.2試藥 氧化槐果堿(OSC，批號80041122，南京澤朗醫藥科技有限公司)；56°白酒(北京紅星酒業有限公司)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX) 試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒，均購自南京建成生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3動物 50只SPF級昆明種雄性小鼠，體質量為(20±2) g，由西安交通大學實驗動物中心提供，飼養于榆林市第一醫院中心實驗室清潔級動物房,12 h光照和黑夜循環,溫度為(22±2) ℃,相對濕度為50%～60%,標準飼料飼喂,自由飲水。

2 方法

2.1動物分組、模型制備及動物處理 隨機將50只小鼠分為5組，即正常對照組、模型組、OSC低(10 mg·kg-1)、中(20 mg·kg-1)、高(40 mg·kg-1)劑量組。適應性飼喂1周后，OSC各劑量組(10、20、40 mg·kg-1)提前預防給藥2 d，同時正常對照組和模型組給予等體積(0.04 mL·g-1)的9 g·L-1生理鹽水；根據文獻方法[16]第3天模型組和OSC各劑量組小鼠均給予56°白酒(6 g·kg-1)灌胃，正常對照組給予等熱量、等體積的糖水(0.5 kg·L-1)灌胃，灌胃后5組均禁食不禁水，6 h后稱取各組小鼠體質量后眼靜脈叢取血，室溫下靜置1 h，于4 ℃以4 000 r·min-1離心10 min，分離血清，分裝于0.5 mL的離心管，置于-20 ℃低溫冰箱中凍存。頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟全葉，用4 ℃預冷的生理鹽水洗凈，經濾紙輕柔吸去表面水分后稱質量，計算肝臟指數。取肝臟小圓葉固定于多聚甲醛溶液(40 g·L-1)中做病理學檢查，其余放入液氮速凍，置于超低溫冰箱中(-80 ℃)保存。

2.2肝臟指數 用公式肝臟指數=肝臟質量÷體質量×100%計算肝臟指數。

2.3血清ALT和AST水平檢測 取部分凍存于-20 ℃冰箱的血清，用752型紫外分光光度儀和AST、ALT試劑盒檢測小鼠血清ALT和AST水平。

2.4肝組織SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量測定 用4 ℃預冷的9 g·L-1生理鹽水將超低溫(-80 ℃)冰箱冷凍的肝組織制成10%肝組織勻漿液，于4 ℃以3 500 r·min-1離心10 min，取上層清液。按照 SOD、CAT、GSH-Px和MDA試劑盒操作說明，用752型紫外分光光度儀檢測上層液中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。

2.5病理學檢查 將固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液的肝臟小圓葉進行常規脫水、石蠟包埋切片、蘇木素-伊紅(HE) 染色，光鏡下觀察其肝組織形態學變化。

3 結果

3.1小鼠一般情況、體質量及肝臟指數的變化 模型組和OSC各劑量(10、20、40 mg·kg-1)組小鼠在酒精灌胃后數分鐘出現翻正反射消失、嗜睡等醉酒狀態，灌酒6 h后小鼠逐漸蘇醒。各組小鼠在實驗結束時均無中毒死亡情況，體質量亦無明顯變化；模型組小鼠肝臟指數較正常對照組升高，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)；與正常對照組相比,OSC各劑量組肝臟指數增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 OSC對小鼠初始體質量、終末體質量和肝臟指數的影響 (n=10)

3.2OSC對小鼠血清肝損傷標志酶ALT和AST的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT和AST水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，表明小鼠急性酒精性肝損傷模型建立成功；給予OSC(10、20、40 mg·kg-1)預處理后，OSC各劑量組小鼠血清ALT和AST水平顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.01)，提示OSC(10、20、40 mg·kg-1)預處理對小鼠酒精性肝損傷有保護作用。結果見表2。

表2 OSC對小鼠血清肝損傷標志酶ALT和AST的影響 (n=10)

3.3肝臟病理學檢查 光鏡下，將小鼠肝臟組織切片進行HE染色后，正常對照組可見肝小葉輪廓清晰，肝板以小葉中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝細胞排列整齊(見圖1)；模型組可見肝小葉結構破壞，肝板列紊亂，呈點狀、片狀壞死，胞漿中可見大小不等、數量不一的圓形脂肪空泡，小葉中央靜脈周圍和匯管區有大量炎細胞浸潤(見圖1)；OSC(10、20、40 mg·kg-1)預防給藥后肝臟細胞間隙水腫明顯減輕，有散在炎細胞浸潤，肝細胞索排列較整齊，肝細胞呈多邊形，細胞分界清晰，核圓而清晰，位于細胞中央，提示OSC具有顯著改善急性酒精性肝損傷小鼠組織病理學結構的作用。

圖1 急性酒精性肝損傷小鼠肝臟病理切片 (HE×200)

3.4OSC對小鼠肝組織SOD、CAT、GSH-Px和 MDA的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織SOD、CAT和GSH-Px活性顯著下降(P<0.01)，MDA含量顯著提高(P<0.01)，提示酒精可誘導肝臟發生氧化應激損傷，導致氧化與抗氧化水平失衡；OSC(10、20、40 mg·kg-1)預防給藥后可明顯逆轉肝組織SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶的活性(P<0.05或P<0.01)，且顯著降低肝臟MDA含量(P<0.01)，并且隨著劑量增加效果更明顯，提示給予OSC預防給藥能夠明顯提高抗氧化酶的活性，減輕酒精引起的肝組織氧化損傷。見表3。

表3 OSC對小鼠肝組織SOD、CAT、GSH-Px和MDA的影響 (n=10)

4 討論

ALD具有較高的發病率和嚴重的不良預后，嚴重危害人類的身體健康。因此，尋找合適的藥物防止ALD的發生發展是當務之急。天然抗氧化植物及其成分已成為抗急性酒精性肝損傷藥物研究的熱點[3]。本研究參考文獻方法[16]選用昆明種小鼠給予56°白酒一次性灌胃(6 g·kg-1)，建立小鼠急性酒精性肝損傷模型；并參考文獻[17-18]報道的OSC的半數致死量(LD50)，設計了低、中、高3個劑量(10、20、40 mg·kg-1)組。實驗結果顯示，OSC(10、20、40 mg·kg-1)預處理2 d后，各劑量組均未出現小鼠死亡；OSC顯著改善了急性酒精性肝損傷小鼠的肝腫大，降低了肝臟指數；組織病理學結果表明，OSC顯著減輕肝臟炎性水腫，提示本研究OSC給藥劑量范圍設計適當，且在該劑量范圍內OSC對急性酒精性肝損傷小鼠具有一定的保護肝作用。

ALT和AST是肝細胞損傷的重要標志酶，在正常血清中ALT和AST含量很低，當肝細胞受損時，肝細胞中的ALT和AST進入外周血清中，導致血清中ALT和AST含量明顯升高[19]。本研究結果顯示，模型組小鼠血清ALT和AST含量較正常對照組明顯增高，且ALT增高幅度大于AST，此結果與文獻[19]報道一致。而相關文獻報道[20-21]，AST的增高幅度大于ALT，其原因可能與小鼠飲酒量以及持續時間不同而導致肝損傷的嚴重程度不同有關。給予OSC(10、20、40 mg·kg-1)干預后，小鼠血清中的ALT和AST含量呈劑量依賴性下降，尤其是ALT含量顯著降低，其降酶機制可能與OSC維持細胞膜穩定性、減少肝細胞損傷，進而減少肝細胞ALT、AST外漏有關，表明OSC對急性酒精性肝損傷具有一定的保護作用。

經胃腸道吸收的酒精約90%經過乙醇脫氫酶(ADH)途徑、細胞色素P4502E1(CYP2E1)途徑和還原型輔酶Ⅱ(NADPH )途徑代謝為具有毒性的乙醛，并產生ROS。過量的 ROS 會導致氧化應激狀態，促進脂質過氧化，產生脂質過氧化產物，如 MDA，還會耗盡抗氧化酶，如SOD、CAT和GSH-Px[21-22]。本研究結果顯示，OSC(10、20、40 mg·kg-1)預處理后，肝組織中SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性顯著提高，而MDA含量顯著下降，表明OSC可減輕急性酒精性肝損傷小鼠的肝臟腫大程度、改善肝組織病理學結構、降低血清中ALT和AST含量，并增加肝組織SOD、CAT和GSH-Px活性，從而提高小鼠的抗脂質過氧化能力，降低肝細胞的壞死程度，修復肝細胞損傷。

綜上所述，OSC對急性酒精性肝損傷有一定的保護作用，該作用可能與其通過增強機體抗氧化能力、清除自由基、抑制脂質過氧化反應和維持肝細胞膜穩定性有關。