固本化瘀法對2型糖尿病大鼠足細胞損傷及信號通路的影響

陸 軍，李 紅

(1.山西省中西醫結合醫院藥劑科，太原 030013；2.山西省中西醫結合醫院腎病二科，太原 030013)

糖尿病腎病是常見的糖尿病微血管并發癥，也是終末期腎臟病常見的病因之一[1]，發病機制復雜且缺乏有效的防治手段。足細胞損傷是貫穿糖尿病腎病的病理環節，高糖及糖基化終末產物刺激、炎癥及氧化應激反應激活等可造成腎病蛋白(nephrin)、足細胞蛋白(podocin)和CD2相關蛋白(CD2AP)等足細胞標志分子表達下調，進而造成足細胞損傷、腎小球濾過膜通透性增加并產生蛋白尿[2-4]。中醫認為糖尿病腎病屬于“消渴”、“尿濁”、“虛勞”范疇，病機總屬本虛標實，本虛指脾腎虧虛，標實指痰濕血瘀，根據病機主張給予固本化瘀方進行治療。相關細胞實驗發現，固本化瘀法含藥血清對高糖引起的足細胞損傷具有保護作用[5]；另有多囊卵巢綜合征及胰島素抵抗相關的研究證實，固本化瘀法能夠促進大鼠體內磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)通路激活[6]。基于此，本研究將以2型糖尿病大鼠作為實驗對象，觀察固本化瘀法對大鼠足細胞損傷及PI3K/Akt通路的影響，旨在探究固本化瘀法在糖尿病腎病防治中的作用及機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 全自動生化分析儀(GE公司)；正置顯微鏡(Nikon公司)；熒光定量PCR儀(Bio-rad公司)；凝膠成像系統(上海天能公司)。

1.2試藥 HE染色試劑盒(上海碧云天公司);RNA提取、cDNA第一鏈合成、熒光定量PCR試劑盒，均購自北京天根生化公司;p-PI3K和p-Akt一抗，均購自Abcam公司。固本化瘀方的藥材包括鹿角膠、龜甲膠、枸杞、黨參、淫羊 董、巴戟天、川斷、當歸、丹參、莪術、三棱、蒼術、香附、膽 南星、茯苓、陳皮和半夏，由本院藥劑科采購，按每毫升生藥含量25、15、5 g制備濃煎藥汁，待使用時進行稀釋。

1.3動物 成年雄性SD大鼠，湖南嘉泰實驗動物有限公司，體質量為180～200 g，動物實驗許可證號：SCXK(湘) 2019-0003。

2 方法

2.1分組、造模及給藥 將SD大鼠隨機分為對照組、模型組及固本化瘀方低、中和高劑量組，每組各10只。對照組用普通飼料喂養，其余各組用高脂高糖飼料喂養；6周后禁食不禁水過夜，對照組一次性腹腔注射等體積溶媒，其余各組以65 mg·kg-1一次性腹腔注射10 g·L-1鏈脲佐菌素，1周后經尾靜脈檢測空腹血糖(FBG)≥11.1 nmol·L-1認為造模成功。造模成功后，固本化瘀方低、中、高劑量組分別給予含有22.1、44.2、88.4 g·kg-1生藥的固本化瘀方藥液灌胃，對照組及模型組給予等體積蒸餾水灌胃，灌胃劑量為0.01 mL·g-1，每日1次，連續4周。

2.2生化指標檢測 末次給藥后將大鼠放入代謝籠、收集24 h尿液，采用生化分析儀檢測尿微量白蛋白(mAlb)及尿肌酐(Ucr)，計算尿mAlb/Ucr；斷頭處死大鼠，立即收集血液樣本5～6 mL，離心分離血清后采用生化分析儀檢測FBG、血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)。

2.3腎臟病理改變檢測 處死大鼠后解剖腎臟組織適量，用體積分數為4%的多聚甲醛固定后制作4 μm病理切片，采用HE染色試劑盒進行染色后在顯微鏡下觀察腎臟病理改變。

2.4足細胞標志分子mRNA表達檢測 處死大鼠后解剖腎臟組織適量，采用RNA提取試劑盒分離提取組織中的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄實驗、合成cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒進行PCR實驗，對目的基因nephrin、podocin、CD2AP及內參基因β-actin進行擴增，反應體系為cDNA 2 μL、預混液 10 μL、10 μmol·L-1上游引物及下游引物各0.4 μL、去離子水補足至20.0 μL。完成PCR反應后生成反應的循環曲線、得到循環閾值(Ct)，以β-actin為內參，計算nephrin、podocin、CD2AP的mRNA表達水平。

2.5p-PI3K、p-Akt蛋白表達檢測 處死大鼠后解剖腎臟組織適量，采用組織裂解液進行勻漿，提取組織蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，取30 μg蛋白樣本進行電泳以分離不同相對分子質量的蛋白，電轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，用體積分數5%脫脂牛奶在室溫封閉PVDF膜1 h，用1∶1 000稀釋的p-PI3K、p-Akt一抗或1∶5 000稀釋的β-actin一抗在4 ℃孵育PVDF膜過夜，次日用1∶2 000稀釋的二抗在室溫孵育PVDF膜1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到p-PI3K、p-Akt及β-actin的條帶及吸光值，以β-actin的吸光值為內參、計算p-PI3K及p-Akt的表達水平。

3 結果

3.1各組大鼠生化指標比較 與對照組比較，模型組大鼠FBG、Scr、BUN和尿mAlb/Ucr均顯著升高(P<0.05)；固本化瘀方低、中和高劑量組大鼠FBG與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)，Scr、BUN和尿mAlb/Ucr均顯著降低(P<0.05)。結果見表1。

表1 各組大鼠生化指標比較

3.2各組大鼠腎臟病理改變比較 對照組大鼠腎臟組織結構清晰，腎小球形態正常；模型組大鼠腎臟內腎小球萎縮，洗膜及基底膜增厚，少量炎癥細胞浸潤；與模型組比較，低、中和高劑量組大鼠腎臟的病理改變明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟病理改變的比較 (HE染色)

3.3各組大鼠腎臟中足細胞標志分子mRNA表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中nephrin、podocin和CD2AP的mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，固本化瘀方低、中和高劑量組大鼠腎臟組織中nephrin、podocin和CD2AP的mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組大鼠腎臟中nephrin、podocin和CD2AP的比較

3.4各組大鼠腎臟中PI3K/Akt通路比較 與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織p-PI3K、p-Akt的表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，固本化瘀方低、中和高劑量組大鼠腎臟組織中p-PI3K、p-Akt的表達水平顯著增加(P<0.05)，結果見圖2和表3。

圖2 各組大鼠腎臟中p-PI3K、p-Akt的電泳圖

表3 各組大鼠腎臟中 p-PI3K、p-Akt的比較

4 討論

足細胞是位于腎小球基底膜外側的一種高度分化的終末細胞，參與腎小球濾過膜的構成，足細胞損傷貫穿糖尿病腎病的病程始終，減輕足細胞損傷也成為近年來防治糖尿病腎病的重要靶點[7-8]。足細胞中nephrin、podocin和CD2AP等分子參與構成足細胞裂隙膜，上述分子表達降低被視作足細胞損傷的標志[9-12]。本研究采用高脂高糖飼料喂養及鏈脲佐菌素腹腔注射的方式建立2型糖尿病模型，造模后檢測到Scr、BUN和尿mAlb/Ucr水平升高，腎臟出現了典型的糖尿病腎病病理改變且nephrin、podocin和CD2AP的表達降低，表明2型糖尿病大鼠出現了腎功能損害及足細胞損傷。

根據中醫理論，糖尿病腎病的發病與陰陽兩虛、氣滯血瘀有關，固本化瘀法能夠通過益氣養陰、活血化瘀、健脾固腎等發揮治療糖尿病腎病的作用[13-14]。本研究在2型糖尿病大鼠造模后給予不同劑量固本化瘀方治療，治療后Scr、BUN、尿mAlb/Ucr水平均明顯降低且腎臟病理改變明顯減輕，表明固本化瘀方能夠減輕2型糖尿病大鼠的腎臟損害。固本化瘀方相關的細胞實驗證實，該方的含藥血清能夠減輕高糖引起的足細胞損傷，本研究觀察固本化瘀方減輕2型糖尿病模型大鼠足細胞損傷的作用，結果顯示,不同劑量固本化瘀方干預后，腎臟組織中nephrin、podocin和CD2AP的表達增加，與既往文獻在離體細胞中的實驗結果[5]吻合，表明固本化瘀方能減輕2型糖尿病大鼠的足細胞損傷。

足細胞損傷的發病機制復雜，且與PI3K/Akt通路和TGF-β/Smad通路的異常激活或抑制密切相關[15-17]。PI3K/Akt通路以磷酸化的形式發生激活，激活后具有促進細胞存活及增殖、抑制細胞凋亡的作用。相關的動物實驗及細胞實驗研究表明，糖尿病大鼠的腎臟組織中以及高糖處理的腎小球內皮細胞及足細胞中p-PI3K和p-Akt的表達水平降低[18-20]。本研究觀察到2型糖尿病大鼠腎臟中p-PI3K、p-Akt的表達水平降低，與既往文獻報道一致。固本化瘀方具有激活PI3K/Akt通路的作用，本研究在使用不同劑量固本化瘀方干預后觀察到腎臟組織中p-PI3K和p-Akt的表達水平增加，表明固本化瘀方能夠促進2型糖尿病大鼠腎臟組織中PI3K/Akt通路的激活，這也可能是固本化瘀方減輕腎臟病理改變及足細胞損傷的分子機制。

綜上所述，2型糖尿病大鼠存在足細胞損傷的情況，由于激活PI3K/Akt通路是固本化瘀法減輕足細胞損傷的可能分子機制，固本化瘀方干預能夠減輕2型糖尿病大鼠足細胞損傷，本研究為今后防治糖尿病腎病、減輕足細胞損傷提供了實驗依據。