3所綜合性醫院分離的多重耐藥銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM的表達分析

馮金鑫，張瑞琴

(1.山西醫科大學藥學院，太原 030001；2.山西醫科大學第二醫院藥學部，太原 030001)

銅綠假單胞菌(PA)對多種抗菌藥物表現為固有或獲得性耐藥，在呼吸科和ICU感染率較高，免疫力低下患者易被感染[1]。近年來，由于臨床診療手段的提高以及抗生素的不合理使用，使多重耐藥PA的分離率增加[2]。研究表明，PA的耐藥機制包括產生抗生素滅活酶或修飾酶[3]、外膜的滲透性降低及通道蛋白缺失[4]、形成生物膜及主動外排系統[5]等。主動外排泵在PA的耐藥機制中起重要作用，在所報道的外排泵中，MexAB-OprM的作用尤為明顯，其具有廣泛的底物特異性，會造成PA對多種類型的抗生素天然耐藥[6]。本課題組采用實時熒光定量PCR (RT-PCR)法檢測臨床分離多重耐藥PA外排泵表達情況,探討多重耐藥與外排泵之間的關系，同時檢測調控基因mexR、nalC和nalD，觀察基因突變與表達之間的關系，以期為臨床治療提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 Cytation酶標儀(美國 Biotek公司)；DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；熒光定量PCR系統(美國Applied Biosystems公司)。

1.2試藥 哥倫比亞血瓊脂培養基(濟南百博生物技術股份有限公司)；外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰(Sigma公司)；抗菌藥物頭孢他啶、頭孢哌酮舒巴坦、氨曲南、亞胺培南、阿米卡星和環丙沙星，均購自中國食品藥品檢定研究院；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、柱式細菌總RNA抽提純化試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3菌株來源 收集2018年7月～2019年7月山西省太原市3所綜合性醫院分離的多重耐藥PA 31株。菌株均經過基質輔助的激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)鑒定。質控菌株為ATCC27853，購自中華人民共和國衛生部臨床檢驗中心。對照株野生型銅綠假單胞菌(PAO1)，購自南開大學生命科學學院分子微生物學與微生物工程實驗室。

2 方法

2.1抗菌藥物敏感性試驗與最小抑菌濃度(MIC) 根據臨床實驗室標準化協會指南(CLSI2020)[7]，利用肉湯稀釋法進行頭孢他啶、頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南、環丙沙星、阿米卡星和氨曲南的敏感性試驗。對3種或3種以上的抗菌藥物同時耐藥定義為多重耐藥。耐藥指數用耐藥的抗生素種類數與送檢的抗生素種類數的比值表示。將PA ATCC27853作為抗菌藥物敏感性試驗的質控菌株。

2.2主動外排泵的表型篩選試驗 根據臨床實驗室標準化協會指南(CLSI2020)，加外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺(PAβN，最終質量濃度為50 mg·L-1),再次利用肉湯稀釋法測定每株菌對頭孢他啶、頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南、環丙沙星、阿米卡星和氨曲南的MIC。如果加上外排泵抑制劑后，MIC值降低，表明外排泵表型篩選為陽性[8]。

2.3膜融合蛋白基因mexA的mRNA表達水平測定 將PA接種于哥倫比亞血瓊脂培養基，過夜培養，嚴格按照柱式細菌總RNA抽提純化試劑盒說明書提取PA總RNA。用紫外分光光度計測定D260/280(RNA濃度)、D260/230(RNA濃度)，根據測定值計算mRNA濃度。按照反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄成cDNA，反應條件設置為25 ℃ 5 min、55 ℃ 15 min、85 ℃ 5 min，處理后，放置于冰上[9]。熒光定量PCR儀檢測mexA的mRNA表達水平，引物序列根據文獻設計，見表1，由上海生工科技公司合成[10]。每株細菌的目的基因及內參基因均做3個復孔，取平均每個反應管內的熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數(Ct)值，實驗菌株目的基因mexA表達量是相對于PA ATCC27853目的基因mexA的表達量計算得出的(定義ATCC27853的目的基因mexA的表達量為1)，將mexA基因的表達量較對照株表達量≥2倍定義為高表達菌株[11]。反應條件設置為95 ℃ 3 min 預變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，95 ℃ 15 s,共進行40個循環，采用2-△△Ct進行實驗結果的計算，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組。

2.4PCR擴增調控基因mexR、nalC和nalD及測序 將外排泵表型為高表達的7株PA接種于哥倫比亞血瓊脂培養基，過夜培養，嚴格按照Ezup 柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取PA總DNA。反應體系為25 μL 2×San Taq PCR Mix，5 μL DNA模板，2 μL上下游引物，15 μL Sterilized dd H2O，引物序列見表1。反應條件為預變性94 ℃ 5 min,變性94 ℃ 40 s，退火50 ℃ 60 s，72 ℃延升 60 s，進行30個循環，最后72 ℃延升10 min[12]。PCR產物送上海生工科技公司純化并測序，將測序結果與Genbank中PAO1序列進行比較。

表1 擴增產物mexA、mexR、nalC和nalD的引物序列

2.5統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理，計數資料以率表示，多重耐藥指數與外排泵表達量相關性采用Pearson相關性分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1菌株臨床信息 31株多重耐藥的PA來自3所綜合性教學醫院，其中26株(83.9%)來源于男性，5株來源于女性。送檢標本中，11株(35.5%)來源于痰液，4株(12.9%)來源于尿液，9株(29.0%)來源于分泌物，2株(6.5%)來源于導管尖端，5株(16.1%)來源于血液。送檢標本中，來自燒傷科12株(38.7%)，重癥醫學科9株(29.0%)，神經外科3株(9.7%)，心血管內科7株(22.6%)。

3.2抗生素敏感性試驗 臨床收集的 31株PA均屬于多重耐藥菌，分離出的PA對環丙沙星完全耐藥(100%)，對氨基糖苷類阿米卡星的耐藥率較低(64.5%)，見表2。

表2 菌株對抗生素敏感性試驗結果

3.3主動外排泵的表型篩選 加入外排泵抑制劑PAβN時，耐環丙沙星、頭孢他啶、氨曲南、頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南、阿米卡星的PA外排泵表型篩選陽性率分別為96.8%、44.8%、41.4%、41.4%、40.0%、10.0%。見表3。

表3 加外排泵抑制劑PAβ N菌株MIC變化情況

3.4多重耐藥、外排泵表達和調控基因mexR、nalC、nalD突變分析 7株PA多重耐藥指數范圍為0.83～1.00(0.94±0.08)，其中4株屬于完全耐藥。以PAO1為對照菌，mexB相對表達量范圍為1.56～10.03(2.29±0.60)，4株屬于外排泵的高表達。多重耐藥指數與外排泵表達量之間相關系數為0.225，且P<0.05,表明多重耐藥與外排泵表達量之間具有相關性，擴增產物經測序并與Genbank中公布的序列比對，有7株PA發生基因突變，其中mexR突變有2株，nalC突變有7株，nalD突變有3株。見表4。

表4 耐藥指數、外排泵表達量和調控基因mexR、nalC和nalD突變分析

4 討論

PA是醫院常見的條件致病菌，易在潮濕環境中生長，氧氣濕化瓶、淋浴頭等常會被PA污染，是造成院內感染暴發的主要原因。由于臨床經驗性用藥以及抗菌藥物的不合理使用，PA極易發生由敏感菌向耐藥菌的迅速轉變。因此，從細菌耐藥性產生的機制進行分析，對指導臨床合理應用抗菌藥物具有十分重要的意義[13]。

本研究對來自3所綜合性教學醫院分離的31株多重耐藥的PA進行外排泵MexAB-OprM基因分析。標本主要來源于燒傷科和重癥醫學科，這2個科室的患者有其自身的特點：重癥醫學科患者病情危重，侵入性治療較多，且自身免疫力低下，抗生素應用較多，因而成為多重耐藥PA的主要人群[14]；燒傷科患者大多由于皮膚黏膜大量損傷而失去屏障，易導致環境或皮膚表面的條件致病菌入血，住院時間長，普遍使用廣譜抗菌藥物，極易感染多重耐藥菌，而多重耐藥PA給臨床治療帶來極大困難[15]。

多重耐藥PA的耐藥機制極為復雜，細胞膜通透性降低、鈍化酶產生、外排泵產生、通過染色體變異及質粒轉導獲得耐藥基因、生物膜的產生等[16]。本文針對外排泵的耐藥機制進行研究，聯合外排泵抑制劑PAβN進行外排泵的表型篩選試驗，結果顯示，耐環丙沙星PA外排泵表型篩選陽性率最高(96.8%)，提示環丙沙星的耐藥機制以產外排泵為主，與Goli H R等[17]研究結果相似。研究表明，氨基糖苷類藥物的耐藥機制主要取決于氨基糖苷類藥物修飾酶，它主要通過共價修飾的方式使氨基糖苷類藥物與核糖體的結合減少，從而導致耐藥。本研究發現，耐阿米卡星PA外排泵表型篩選陽性率最低(10.0%)，進一步證實外排泵產生在氨基糖苷類的耐藥機制中發揮的作用較小[18]。

耐藥指數表示菌株的耐藥程度，0表示待測菌株對所測的抗生素全部敏感，1表示完全耐藥。本研究對選擇的7株耐藥指數高且平均值為0.94的PA進行膜融合蛋白基因mexA的mRNA表達量分析，結果顯示，其外排泵MexAB-OprM相對表達量均較高，且多重耐藥指數和外排泵表達量的相關系數為0.225，表明多重耐藥與外排泵表達量之間具有相關性。為了進一步研究MexAB-OprM高表達機制，對7株PA的mexR、nalC和nalD基因產物進行測序，2株發生mexR突變，7株發生nalC突變，3株發生nalD突變，且出現氨基酸的替換。結果顯示，Pa12 mexR基因在377位由T突變成A,導致纈氨酸突變為谷氨酸，與Ziha-Zarifi I等[19]的研究結果一致；Pa12和Pa16在nalC基因212位由G突變為A，導致甘氨酸突變為谷氨酸，在625位A突變為C，導致絲氨酸突變為精氨酸，這種類型的突變與Pan Y P等[20]的研究結果一致；Pa6、Pa15、Pa23和Pa24在147位由G突變為A，導致天冬氨酸突變為天冬酰胺。氨基酸的替換會影響阻遏蛋白mexR、nalC和nalD的結構，使其不能與操縱子結合，從而導致主動外排泵的高表達，導致對多種抗菌藥物耐藥。

外排泵MexAB-OprM在多重耐藥PA中起著重要作用，外排泵調控基因突變可導致MexAB-OprM表達增強，從而形成獲得性耐藥。因此，對本地區3所綜合醫院多重耐藥PA進行監測，了解耐藥菌株的特點，為臨床醫生合理選用抗菌藥物提供科學依據。