慢性髓性白血病患者BCR-ABL融合基因的規范化檢測及臨床應用

秦亞溱

(北京大學人民醫院，北京大學血液病研究所，國家血液系統疾病臨床醫學研究中心，北京 100044)

慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一種起源于多能造血干細胞的惡性腫瘤，染色體易位t(9;22)(q34;q11)形成的BCR-ABL融合基因是其特征性分子標志[1-2]。本世紀以來，靶向BCR-ABL的伊馬替尼等酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)的應用給CML治療帶來革命性變化，絕大部分患者的生存期已與常人相同，并可能實現功能性治愈[3-4]。BCR-ABL定量及突變檢測是CML患者診斷及長期治療過程中療效監測的基本手段，而檢測規范化是其發揮臨床指導作用的前提, 也是CML患者獲得最佳療效的保證。在此，將對CML患者BCR-ABL的規范化檢測及臨床應用展開探討。

1 CML患者BCR-ABL融合基因類型

Ph染色體是人類發現的第一個與特異惡性疾病----CML相關的染色體異常，隨后確認是由染色體易位t(9;22)(q34;q11)所致[1]。在分子水平上，該異位導致22號染色體上的BCR與9號染色體上的ABL形成BCR-ABL融合基因[2]，從而使得ABL酪氨酸激酶處于持續活化狀態，這是CML發生的核心機制[5]。

在DNA水平上，BCR基因斷裂的區域主要分布于3處[6]：①內含子1，又稱為次要斷裂點簇集區(m-bcr)；②外顯子12～16，又稱為主要斷裂點簇集區(M-bcr)；③內含子19，又稱為μ-bcr；ABL基因的斷裂區域跨越外顯子1b上游、外顯子1b和1a及外顯子1a下游。BCR-ABL融合基因轉錄翻譯后分別形成以下3種mRNA和蛋白：e1a2(P190)、e13a2/e14a2(均為P210)和e19a2(P230)；④還有少見的融合類型，如e6a2、e13a3/e14a3等。為了保持讀碼框以正確翻譯ABL蛋白，BCR和ABL之間可能插入部分內含子等序列或者BCR斷裂發生在外顯子上，如e8-int1b-a2等[7]。

90%～95%的CML患者初診時可檢測到Ph染色體。所有的CML患者均具有BCR-ABL融合基因，我們及國際報道均顯示約98% CML患者的BCR-ABL為P210型，其余2%為P230、P190或其它少見類型[7]。

2 BCR-ABL檢測方法

由于P210型BCR-ABL在mRNA水平表現均一，因此可以將mRNA逆轉錄為cDNA后再通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增來確認BCR-ABL融合基因的存在。與傳統PCR技術相比，實時定量PCR技術是在反應體系中除了上下游引物之外加入了熒光探針或染料，通過實時檢測擴增反應中每一個循環的產物的熒光信號，實現真正準確的定量起始模板。實時定量PCR檢測P210型BCR-ABLmRNA具有特異、敏感、快速以及準確定量的特點，是當前臨床常規的檢測方法[8-9]。進行實時定量PCR時，分別檢測BCR-ABL和內參基因(如ABL)定量各自拷貝數，BCR-ABLmRNA水平表示公式如下。

(BCR-ABLcopies/ABL copies)×100%

對于P190和P230型BCR-ABL亦可分別采用各自特異的實時定量PCR檢測方法。對于各種少見BCR-ABL類型，可通過多重定性或定量方法結合Sanger測序確定其存在以及融合類型[7]。

目前ABL突變檢測的標準方法是PCR結合Sanger測序法[8-9]，首先進行巢式PCR，即先擴增BCR-ABL，然后擴增BCR-ABL上的ABL酪氨酸激酶區(包含第240～500個氨基酸)，再通過Sanger測序來明確BCR-ABL是否發生突變以及突變類型。

3 CML患者BCR-ABL檢測的臨床應用

BCR-ABL定量及突變檢測對于CML患者診斷及監測具有重要意義。

3.1診斷 CML確診主要依據形態學、細胞遺傳學和分子學3個方面。對于絕大多數CML患者，Ph染色體及BCR-ABL融合基因這兩項檢測結果一致。由于P210型BCR-ABL是CML患者的普遍類型，通過實時定量PCR檢測到該mRNA并結合血液形態學表現即可快速確診。對于P210型BCR-ABL陽性但Ph染色體未檢測到的情況，往往是由于異位隱匿或復雜異位掩蓋所致，仍可以診斷為CML。當檢測到Ph染色體而P210型BCR-ABL未檢測到時，提示存在其他的BCR-ABL類型，需通過多重PCR方法進行全面的BCR-ABL類型篩查，并通過熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)技術確認BCR-ABL融合基因的存在。2020年歐洲白血病網(ELN)關于CML治療的推薦提出，CML患者初診時需確定BCR-ABL融合基因類型，以便后續監測分子學反應采用合適的檢測體系[10]。

3.2指導治療 TKI是當前CML治療的一線藥物。由于大部分CML患者可以通過TKI治療很快獲得完全細胞遺傳學緩解(CCyR)，更低水平的腫瘤負荷需要采用更加敏感的分子學檢測技術。采用實時定量PCR技術檢測BCR-ABLmRNA水平可以準確反映白血病負荷，可用于CML患者分子學反應評估。ELN推薦、美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南及中國CML指南中對CML患者TKI療效評估，均采用里程碑的方式[10-12]，即依據治療后特定的時間點是否獲得特定的細胞遺傳學(Ph染色體陽性率)及分子學反應(BCR-ABLmRNA水平)，評估患者是否獲得最佳療效，并提示是否需要換用二代或三代TKI。2020年版ELN推薦進一步簡化為僅根據特定時間點的BCR-ABLmRNA水平評估TKI療效，見表1[10]。

表1 歐洲白血病網(ELN)推薦：慢性髓性白血病治療(2020年版)[10]

研究顯示，CML患者獲得深層次的分子學反應(一般認為≥MR4.5，即BCR-ABLmRNA水平較初診下降≥4.5 logs)之后有可能停用TKI并保持主要分子學反應(major molecular response, MMR)，指BCR-ABLmRNA水平較初診下降3 logs即實現功能性治愈[13]。停藥既能提高患者生存質量又可以降低國家醫療保險負擔，因而是當前CML治療追求的目標。BCR-ABLmRNA水平既是停藥也是停藥后重新服藥的基本指征，在停藥前后均需要定期密切監測。

TKI治療過程中可能發生耐藥，ABL酪氨酸激酶區發生突變是耐藥的重要原因[14]。依據指南評估，當正確服藥的CML患者未獲得最佳療效時需要進行ABL激酶區突變檢測[10-12]。由于二代TKIs和三代TKIs對不同的突變類型敏感性不同，因此突變表現可指導后續TKIs的選擇[10-12]。

4 CML患者BCR-ABL定量檢測國際標準化

與其他的血液學診斷技術相比，PCR具有實驗步驟和影響因素較多的特點。檢測結果準確、穩定是BCR-ABL監測真正發揮臨床指導作用的前提。為做到這一點，必須采用標準化的實驗方案，執行嚴格的室內質量控制措施，這樣才能讓患者在同一家實驗室檢測的結果具有可比性，正確評估分子學反應，指導臨床治療。

由于試劑、儀器以及內參基因的不同等影響，既使檢測準確、穩定，不同實驗室檢測同一份樣本得出的BCR-ABLmRNA水平很可能不同，因此不同實驗室的結果不具有可比性。為解決這個問題，國際CML專家于2005年共同提出BCR-ABL定量檢測國際標準(international scale, IS)的概念[15]，即通過轉換系數(conversion factor, CF)，將各實驗室BCR-ABL檢測值均轉換為國際標準值(BCR-ABLIS)，根據BCR-ABLIS可直接判斷CML患者分子學反應，常用的分子學反應指標及定義。見表2。

表2 慢性髓性白血病常用分子學反應指標及定義

因此，通過采用國際標準化的BCR-ABL可以正確評估CML患者分子學反應，從而有效發揮臨床治療指導作用。目前BCR-ABLIS僅適用于具有P210型BCR-ABL的CML患者，其他類型的BCR-ABL尚未引入國際標準化的概念，分子學反應可采用與初診相比BCR-ABL下降log的評估方式。

5 用于轉換BCR-ABLIS的CF獲得

執行BCR-ABL國際標準化的核心是CF，有效CF的獲得可通過與參比實驗室交換樣品或與商業化標準物比對來實現。其中前者應用更為廣泛。與參比實驗室比較過程，通常包括兩批派發樣本檢測比對[16-17]，第一批比對是為了計算CF，第二批為了驗證CF，即評估計算出的CF是否可以準確轉換第二批樣本BCR-ABL。只有驗證結果合格，才能說明BCR-ABL檢測準確并穩定，該CF可用于CML患者轉換BCR-ABL。澳大利亞醫學和獸醫科學研究所(IMVS)國際參比實驗室報道[16]，與IMVS進行樣本交換38家實驗室中有19家進行了驗證，其中11家合格獲得有效的CF，利用有效CF轉換BCR-ABLIS之后使得實驗室間MMR一致率明顯提高。歐洲亦開展了基于樣本比對的CF獲得的工作[17]，他們形成多級網絡，即首先由位于德國曼海姆的國際參比實驗室驗證26個國家級參比實驗室獲得有效CF，再由這些實驗室驗證本國的其他實驗室。

6 國內BCR-ABL定量檢測規范化進展

為了實現BCR-ABL規范化檢測并緊跟國際進展，北京大學人民醫院北京大學血液病研究所于2010年牽頭啟動了國內白血病分子檢測領域首個多中心規范化項目—“中國CML患者定量PCR檢測合作項目”。 2012年，北京大學血液病研究所通過與澳大利亞IMVS國際參比實驗室比對獲得有效CF。隨后，北京大學血液病研究所做為國內唯一的參比實驗室，每年通過兩批樣本派發比對幫助其他實驗室獲得有效CF[18]。到目前為止，全國實驗室參與本項目80余家，其中73家已獲得CF實現臨床報告BCR-ABLIS。此外，CF獲得后并非一勞永逸，只有在檢測穩定的前提下才一直可用。就此，北京大學血液病研究所每年還通過派發一批次比對樣本來進行已獲得CF實驗室的再驗證[19]，如果合格說明檢測穩定CF繼續使用，如果不合格則提示檢測過程出現問題，實驗室需要檢查操作規程，針對新的檢測狀態需要重新計算CF。因此，“中國CML患者定量PCR檢測合作項目”促進了國內CML分子學反應評估與國際接軌，并發揮了BCR-ABL檢測規范化的外部質控的作用。

7 ABL突變的規范化檢測

ABL突變的檢測同樣需要規范化，具體內容可參見已發表的實驗室規范中國專家共識[20]。在此特別強調的是，為保證結果真實可靠，測序圖譜的判讀一定認真謹慎；只有背景干凈的測序圖譜才能用于判斷ABL突變；對于小突變峰如果不好判斷需重新擴增測序。

新一代測序(next generation sequencing, NGS)技術正逐步進入惡性血液病臨床應用，由于其高敏感性及可定量的優點，2020年ELN推薦指出可采用NGS檢測ABL突變[10]。不過目前在國內，尚待數據支持和專門的規范檢測指南的出現。

8 采用外周血標本規范監測CML患者BCR-ABL

規范化的BCR-ABL檢測還體現在樣本類型上。盡管骨髓是白血病患者實驗室檢測的基本樣本類型，但是外周血與骨髓相比具有患者痛苦小、取材方便等優點。CML患者初診時，外周血往往具有與骨髓相似的髓系各階段細胞組成，提示CML患者有可能采用外周血檢測。Brandford等[21]報道，外周血定量檢測BCR-ABL能夠可靠反映CML療效。隨后的有關TKIs治療CML的各個國際臨床實驗均是采用外周血檢測BCR-ABL。江倩等[22]采用國際上最大宗的樣本量，通過外周血與骨髓的配對研究顯示，CML患者接受伊馬替尼治療后外周血與骨髓的BCR-ABLmRNA水平總體上具有很高的一致性，并且外周血比骨髓的敏感性更高。由于基于臨床實驗制定的CML治療指南及推薦中療效評估標準均是基于外周血的數據[10-12]，而有些患者外周血和骨髓結果之間存在一定差異。因此，在執行指南評估CML患者TKIs療效時應該持續采用規范化的樣本----外周血檢測BCR-ABL。

9 結語及展望

基于TKIs的成功研制及廣泛應用，當前CML的診斷、治療及監測已建成完整而清晰的規范化體系，因此目前存在的主要問題在于執行。一方面是臨床層面，除了規范服藥外還需規范監測，CML患者應堅持每3個月做1次外周血BCR-ABL定量檢測，在BCR-ABL提示升高時以及停藥后等特殊階段還需要增加檢測次數，當未達最佳療效時需檢測ABL突變，以便指導臨床治療。另一方面是實驗室層面，需嚴格執行標準操作規程以保證BCR-ABL定量和突變檢測結果準確而穩定，并通過參加樣本比對或與標準品比對的方式獲得CF，以報告BCR-ABLIS，發揮正確的指導臨床治療作用。

分子學檢測在惡性血液病診斷監測中發揮著越來越重要的作用，規范化檢測是發揮臨床指導作用的基石。CML患者BCR-ABL的規范化檢測為其它分子學指標提供了很好的范例。