流式細胞術檢測急性髓系白血病微小殘留病的現狀與進展

王 卉, 陳 曼

(河北燕達陸道培醫院 檢驗科，河北 三河 065201)

流式細胞術(flow cytometry, FCM)是臨床上檢測急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)微小殘留病(minimal residual disease, MRD)常用的技術之一，具有靈敏度高、覆蓋率廣等優點，已被用于復發預測和指導治療方法選擇[1-4]。但FCM檢測AML MRD仍存在諸多難點和問題，如白血病細胞的復雜性、多樣性、抗原漂移以及技術因素等[5-8]。本文結合國內外FCM檢測AML MRD現狀，提出解決上述問題對策、介紹新技術及臨床實用性，有助于提高檢測水平，促進FCM技術檢測AML MRD臨床應用。

1 FCM檢測AML MRD現狀及問題

FCM檢測AML MRD經歷20多年發展：①雖然儀器分類為4～20色，但是目前常用流式細胞儀為8～10色，建議做8色及以上方案[9-10]；全光譜流式儀器在少數醫院開始應用并初見成效；②建議使用白血病相關免疫表型(leukemia-associated immunophenotypes, LAIP)與正常表型差異性(different-from-normal, DFN)相結合的識別模式[9-15]；③設計方案遵循骨架標志+常見異常表達標志原則，使用多標志設門[9-15]；④為了保證靈敏度達到10-3～10-4, 樣本獲取至少活細胞20萬, 最好白細胞在50萬～100萬[9-15]，如果做白血病干細胞(leukemic stem cells, LSC)檢測，獲取活細胞400萬～800萬[16]；⑤外周血比骨髓白血病負荷低，建議首選骨髓[9-10, 17]。為了避免外周血稀釋，建議緊接形態的第一管做FCM[9-10]；⑥腦脊液MRD陽性與不良預后有關，且FCM靈敏度高于細胞學，建議使用FCM法檢測腦脊液[1, 18]；⑦存在抗原漂移可能，不主張根據初治表型使用既定設門法[15, 19-20]；⑧近年來免疫治療等新技術的發展，在MRD檢測同時，對于難治復發病例通過免疫表型檢測，進行靶向治療的靶點篩查；⑨隨著免疫治療后復發機制的研究，開始將腫瘤干細胞、免疫微環境、免疫檢查點與MRD一起進行研究。即FCM檢測AML MRD，從單純實驗室檢查逐步擴展到治療方案選擇。在取得巨大進展，FCM成為臨床上幾乎所有AML患者隨訪必做檢測項目同時，但是FCM檢查MRD也面臨一些問題。

1.1檢測方案 一般使用CD45及髓系原始標志[CD34、CD117、HLA-DR和(或)CD33]作為骨架抗原，結合常見伴系標志(如CD7、CD56、CD2、CD19、CD4等)、異常獲得標志[CD96、CD366(Tim3)等]、過早獲得的成熟階段標志(CD15、CD64、CD11b、CD11c、CD36、CD14等)、表達強度改變的髓系及早期標志(CD13、CD33、CD371、CD38、CD123、CD200等)[9-17]。各種異常的發生率和識別難易度是方案設計的依據[13-17]。有兩種傾向，歐洲白血病網絡(European Leukemia Net, ELN)[10]等選擇固定的統一方案[3-4, 12-17]；另一種為相對個體化方法，即固定骨架和必做標志，留出1～2個熒光通道，根據初治表型選做相應的LAIP標志[9]。

近年來AML LSC有進入MRD檢測的趨勢, 一般認為免疫表型為CD34+/CD38-/CD45RA+/CD123+或者CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123+或者 CD45dimCD34+CD38-CD133+，其他標志有CD371(CLL1)、Tim3、CD7、CD11b、CD22、CD56等[10, 14, 21-23]。CD33、CD44、CD47、CD123、CLL1、Tim3等標志進入靶向治療研究[21-22]。原發AML如果LSC比例高，提示預后不佳；不同AML的LSC異質性強, 且同一患者治療過程中可能會改變[21]。免疫表型和遺傳學有很強的相關性，成為個體化MRD檢測的基礎。見表1[12，24]。

表1 流式細胞術檢測AML MRD標志與發生率

在所有血液腫瘤中，AML對于MRD檢測幾乎是難度最大，室間差異最大，甚至是室內不同檢驗醫師之間差異性最大的項目，原因在于：①AML本身的異質性，包括多種亞型，亞型之間表型差異大，尤其是急性早幼粒細胞白血病和急性巨核細胞白血病，往往需要特殊的MRD方案；②同樣亞型的AML，也經常存在異質性克隆，尤其是急性粒單細胞白血病和急性單核細胞白血病；③隨著治療進行，AML的抗原漂移發生率更高，而且缺乏規律性；④腫瘤之間表型異質性大，每種異常的覆蓋率不高，造成很難用同一個方案高效檢測大多數患者MRD，尤其是使用8色以下機型；⑤MRD是一個定期隨訪項目，國內收費限制一般做8色1～2管，8～16個標志，其中骨架(設門)抗體占據3～8個，導致形成組合有限[3, 5, 9]；⑥初治往往在當地醫院完成，可能檢測的LAIP和DFN標志及組合有限，提供信息有限；⑦由于髓系標志在大量成熟細胞中也表達，AML往往不能使用系別標志設門，而CD34、CD117等早期標志設門的覆蓋率不足90%，是AML漏診的原因之一，尤其是單核細胞和巨核細胞白血病；⑧骨髓中正常存在髓系原始細胞，而AML細胞很多時候與正常細胞表型差異無統計學意義；⑨覆蓋率高的DFN，往往是正常表達標志的熒光強度細微改變，以及標志組合造成的改變，而感染、藥物、個體差異、抗體和組合的強度影響、標本質量、儀器穩定性等原因都會影響檢測結果，人工分析情況下，經驗性的依賴進一步增加檢測精確度的變數。

1.2時間與閾值 多項研究表明，化療早期(16～18 d)、1和2次誘導治療后、鞏固治療后、移植前后(+28 d)，FCM檢測AML MRD對于選擇治療方法，判斷預后有很大意義[2-5，8，15]。造血干細胞移植后6個月內MRD檢測以每月1次為宜，半年后至2年每3個月1次為宜，此外，移植后任何時間如果懷疑患者疾病進展均可進行MRD檢測[5]。關于陽性結果的定義，雖然ELN等選擇0.1%作為閾值[4, 10, 16]，但是低于此閾值也有預后意義[2, 15, 17]。因此，FCM檢測AML MRD的靈敏度10-3～10-4甚至10-5，覆蓋率90%[5, 8, 10]。LSC初治時閾值0.004%～0.03%, 隨訪閾值10-6[14，16]。

影響檢測靈敏度和特異性的原因很多，對于不同的病例，采用統一閾值如0.1%并不恰當。①個體差異，LAIP和DFN標志多的患者，靈敏度可以達到10-4，甚至更高，而不表達早期標志，尤其是與正常髓系細胞表型重疊性高的AML，靈敏度可能連10-2都很難達到；②標本質量，增生差或者嚴重稀釋的標本，容易出現假陰性；③檢測者經驗和能力也是影響檢測結果的重要因素。因此，有些醫院采用的是看到即報的原則。在報告描述中，如果是MRD比例極低或者總體原始細胞比例極低，或者細胞數極少、成熟淋巴細胞比例極高提示標本增生極差，或者粒細胞均為成熟階段缺乏有核紅細胞提示嚴重稀釋等，會在報告中予以注明，這些因素可能會造成假陽性或者假陰性結果。

1.3方案合理性 AML中每種LAIP+DFN組合覆蓋率均不高，為了達到覆蓋率80%以上，經常需要做多管或者差異化方案。目前關于方案設門的觀點：①盡量使用相對復雜的抗體組合去建立正常發育模式和抗原表達情況，DFN方案過于簡單會使MRD與正常細胞重疊度高，導致假陰性；②盡量采用統一化方案，便于積累經驗，使用多維軟件回顧分析數據；③抗體克隆和熒光素會影響抗原表達強度，而伴系表達大多都是弱表達，盡量選擇可信克隆和較強熒光素；④抗原漂移問題在AML中位發生率61%(10%～91%)，且缺乏規律性[15, 19-20]。不能單純根據初治免疫表型使用預設方案檢測。

盡管如此，目前絕大多數醫院雖然在抗體種類和設計的選擇上相似度較高，但是組成方案差異很大。一些著名實驗室的經驗方案供參考[2, 4, 9, 12-14]，見表2。

表2 幾種急性髓系白血病微小殘留病檢測方案

1.4現狀與挑戰 MRD分析是對經驗性分析最大的挑戰，目前部分實驗室還保留在使用CD45/側向散射光(side scatter，SSC)設門的原始階段；實驗室會使用CD34/SSC設門，沒有使用CD117/SSC做內對照，且只能報早期細胞比例，對沒有表達CD7、CD19、CD56的細胞不進行判斷；國內使用HLA-DR/CD45設門彌補CD34/SSC和CD117/SSC設門覆蓋率低(70%～90%)缺陷的單位尚不多；使用標本內對照，進行細微DFN判斷的能力有待加強。

解決方法：①CD45/SSC, CD34/SSC、CD117/SSC、CD45/HLA-DR同步設門，防止漏掉不表達一個或者更多早期標志的MRD(圖1)。如果是罕見的類型，如巨核白血病，需要使用CD42a/CD45、CD61/CD45設門；②幼稚細胞門內尤其是CD117/SSC和(或)CD45/HLA-DR設門，可能同時存在正常和惡性髓系幼稚細胞，殘留正常幼稚細胞是很好的DFN內對照，應該精確設門區分正常與白血病細胞(圖1)；③有些白血病細胞與正常細胞相似度極高，DFN改變很微妙，此時兩種異常的組合會提高靈敏度，甚至使用軟件做多維圖(圖2雷達圖，圖3 tSNE)。相同panel分析的組合越多，維度越多，得到的信息越多；④熟悉正常骨髓表達情況，包括增生的骨髓、不同時間點、藥物與感染以及應激狀態等因素影響等。

圖1 未表達CD34、CD117的AML MRD骨髓標本 紅色細胞群為惡性髓系原始細胞，占有核細胞0.58%，未表達早期標志CD34、CD117，表達HLA-DRbri、CD33bri、CD64、CD11bdim，未表達CD13、CD14。因為CD45/HLA-DR P10設門包括增生的B祖細胞，使用CD45/SSC選擇SSC大的細胞P8設門，因此占有核細胞比例為P8×P10。P5(深藍色細胞群)和P7(深綠色細胞群)為正常增生的髓系原始細胞

圖2 骨髓標本分析 a:正常髓系原始細胞(紅色為CD34陽性早期髓系原始細胞，深藍色為CD117+CD34-晚期髓系原始細胞)。b:AML MRD(紅色為惡性髓系原始細胞，深藍色為正常髓系原始細胞)

圖3 正常與AML MRD骨髓標本的組合tSNE 綠色細胞群為20個正常骨髓標本組成的該方案正常對照圖庫，a.紫色細胞群；b.紅色細胞群；c.粉紅色細胞群分別為3個AML患者MRD細胞

2 技術進步意義

2.1更多功能 質譜流式[25]與全光譜流式[26]克服了傳統流式熒光通道相對較少、相似發射光譜的熒光素不能同時使用、熒光通道之間干擾大和補償較大等缺點，盡管目前存在一些問題(質譜流式靈敏度低、樣本制備和采集速度低、價格高、復雜數據分析等，全光譜流式檢測方案設計復雜、單陽管設置對解析影響大、繁復的數據分析等)，依舊成為行業內期待的革命性機型，各自在MRD檢測中的應用價值及優缺點見表3。隨著質控問題的解決和軟件進步，這些全新流式在臨床應用會極大提高AML MRD檢測的靈敏度和特異性。

表3 傳統流式細胞術與新型流式細胞術的特點比較

2.2軟件進步 Kaluza、Flowjo、Infinicyt、Cytobank等商業軟件的降維功能推動了FCM MRD檢測。初步研究flowSOM檢測AML MRD, 與分子生物學一致率80.2%，靈敏度85%，特異性69%[27]；Infinicyt聚類算法檢測AML MRD靈敏度66.28%, 特異性99.9502%～99.9999%[28]。雖然靈敏度有待提高，但是看到了曙光。

2.3MRD新標志 基因芯片技術的發展極大推動了抗原標志篩查，St. Jude一項研究發現更多有望作為AML MRD檢測的標志(表1)，結合降維軟件，有可能使一部分患者的檢測靈敏度提高到≤0.001%[24]。

2.4單細胞測序技術的結合 陳賽娟院士團隊將免疫表型和RNA-測序(RNA-sequencing，RNA-seq)以及單細胞RNA測序(single-cell RNA-seq，scRNA-seq)整合分析, 發現同一患者標本中，存在不同分化階段的AML腫瘤細胞群[29]，為將來MRD研究拓開新的思路。

3 前景展望

FCM檢測AML MRD，從十幾年前8色流式的推出，在3年前逐漸趨于完善[10]，同時也達到平臺期。超多色流式的推出以及高效智能軟件問世，有望從方案上解決抗體組合覆蓋率低的難題，且同步檢測腫瘤干細胞、免疫細胞亞群、免疫檢查點、靶向治療靶點篩查，以及解決部分人員經驗的問題。但是盡管最理想的狀態下，技術進步可能在未來3～5年將室間差異、人員經驗差異、儀器穩定性、方案優化和規范化等問題解決。鑒于AML的本質，相當長的時間里，找到高度特異性且高覆蓋率的AML MRD的一個標志或者幾個標志組合的可能性很小，即未來可能MRD依舊是能夠檢測到的MRD。

綜上所述，FCM檢測MRD具有很強的臨床指導意義，雖然目前尚在完善中，但是技術進步帶來的推動作用已經顯現，將來可能會在提高靈敏度、特異性的同時，把腫瘤干細胞、免疫微環境、免疫檢查點研究相結合，為臨床提供更加全面的預后信息。