UG-FNAC聯合BRAFV600E突變檢測對TIRADS 4類結節的診斷價值

田姝琪，汪耘吉，譚 孟，李春華，祝玉祥，閆彩鳳，馮尚勇

(1.揚州大學附屬蘇北人民醫院 a.內分泌代謝科；b.普外科，江蘇 揚州 225001；2.大連醫科大學第一臨床醫學院，遼寧 大連 116044)

流行病學表明，高達65%的普通人群可超聲檢出甲狀腺結節(thyroid nodule, TN)，其中惡性結節占10%，甲狀腺超聲是評估其良惡性的基本方法[1]。2017年美國放射學會(American College of Radiology，ACR)提出采取積分制將TN分為ACR-TIRADS(ACR Thyroid Imaging, Reporting and Data System) 1～5類，該方法較以往的TIRADS分類標準更為細致客觀，得到了臨床醫生的廣泛認可。ACR-TIRADS4類TN的惡性風險在5%～20%之間，需要進一步評估其病理性質后制定其治療方案[2]。超聲引導下細針穿刺細胞學檢查(ultrasound-guided fine needle aspiration cytology, UG-FNAC)是國內外指南均推薦的鑒別TN良惡性的主要方法。目前普遍采用Bethesda分類標準進行細胞學診斷，采用液基薄層細胞學技術(thinprep cytologic test, TCT)處理穿刺標本明顯減少了紅細胞的干擾[3]。然而，UG-FNAC受到操作者經驗、病例選擇、結果判讀等影響，仍有20%～30%的結節無法確定良惡性[1, 4]。研究表明，鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1V600E (BRAFV600E)基因突變對甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)具有高度的特異性，是診斷PTC的主要分子標志物，但其敏感性相對較低。目前針對UG-FNAC聯合BRAFV600E基因突變對ACR-TIRADS4類結節的診斷價值的研究尚缺乏相關資料。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2018年1月至2021年6月在揚州大學附屬蘇北人民醫院經超聲檢查評估為ACR-TIRADS 4類的TN，進一步行UG-FNAC和BRAFV600E突變檢測并行手術治療患者471例，男性110例，女性361例，年齡17～78歲，平均(44.2±9.8) 歲，以術后病理診斷為金標準。納入標準：具有完整的臨床資料、甲狀腺功能及抗體檢查、超聲檢查、UG-FNAC細胞學病理結果、BRAFV600E報告和術后組織學病理報告。排除標準：既往甲狀腺手術史、頸部放射治療史及資料不完整的患者。本研究經揚州大學附屬蘇北人民醫院倫理委員會批準，所有患者分別在醫生告知情況后簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1甲狀腺功能及抗體測定 采集患者清晨空腹外周靜脈血，應用德國羅氏全自動發光分析儀(Cobase601)進行測定，促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone, TSH)、游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine, FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine, FT4)、甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody, TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody, TGAb)。參考值范圍分別為：0.27～4.2 mIU/L, 3.1～6.8 pmol/L, 12～22 pmol/L, 0～115 IU/L, 0～34 IU/L。

1.2.2甲狀腺超聲檢查 由相對固定的高年資超聲科醫師對患者頸部進行超聲檢查，并文字記錄TN的影像學特征后存儲TN病灶的具體圖像。使用2017版ACR-TIRADS報告評分系統，對TN進行分類，如果無法分類或超聲評估醫生存在分歧，由2位副高級職稱醫生會診后評分為最終分類。根據縱橫比大于1、實性結節、低回聲、點狀強回聲、邊緣不規則五個可疑特征的數目，將超聲評估為TIRADS4類的結節分為4a類(1個)、4b類(2個)和4c(3～4個)3個亞類[5]。

1.2.3UG-FNAC檢查 經知情同意后，由固定的醫生在超聲引導下對ACR-TIRADS4類TN進行穿刺，將穿刺的針頭在盛有10 ml BD CytoRich Red 固定液的離心管內涮洗，將針管內的標本全部轉移到離心管內并做好標記送檢病理科。本研究UG-FNAC細胞學穿刺結果參照2017版甲狀腺細胞病理學Bethesda報告系統推薦的分類標準，將結果分為6類，將Ⅰ～Ⅳ類定義為良性組，Ⅴ類和Ⅵ類定義為惡性組。

1.2.4BRAFV600E基因檢測 將穿刺所得的樣本進行DNA提取(廈門艾德生物醫藥公司核酸提取試劑)，應用紫外分光光度計測定DNA濃度，其OD260/OD280在1.8～2.0之間，應用熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)法檢測BRAFV600E突變(擴增方法：ADx-ARMS方法；儀器：美國應用生物系統公司StepOnePlus Thermal Cycler；擴增試劑：廈門艾德生物公司的人類BRAFV600E突變檢測試劑盒)。若突變檢測管的FAM信號擴增呈S型曲線且Ct值<30，則為突變型；若樣品的FAM信號擴增曲線不呈S型曲線或Ct值≥30，則為野生型。診斷標準：突變型診斷歸為惡性組，野生型診斷歸為良性組。

2 結 果

2.1臨床資料及術后病理類型 本研究共納入TN患者471例，以術后組織病理結果為金標準分為良性組和惡性組。惡性組298例，均為PTC；良性結節173例，其中結節性甲狀腺腫106例，甲狀腺腺瘤47例，橋本甲狀腺炎7例，肉芽腫性炎10例，局部纖維增生3例。臨床資料分析表明：兩組性別、結節直徑、FT3、FT4、TPOAb、TGAb差異無統計學意義, 但年齡和TSH差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。超聲特點分析表明：兩組之間的結節回聲性質、鈣化類型分布、縱橫比>1、形態及血供分布特點均存在顯著差異(P<0.05)。見表2。兩組的 UG-FNAC和BRAFV600E突變檢測的結果分布均存在顯著差異(P<0.05)。見表3，BRAFV600E突變檢測陽性與陰性情況，見圖1，2。

表1 兩組臨床資料比較

表2 兩組結節超聲特征比較[例(%)]

表3 兩組UG-FNAC和BRAFV600E突變檢測診斷分布比較[個(%)]

圖1 BRAFV600E突變陽性

圖2 BRAFV600E突變陰性

2.2不同檢查方法對TIRADS4類結節的診斷效能 UG-FNAC聯合BRAFV600E突變檢測診斷ACR-TIRADS4類結節的Se和NPV分別為95.6%和92.9%，優于UG-FNAC(75.8%、70.4%)和BRAFV600E突變檢測(56.7%、57.0%)。計算AUC評估診斷效能，UG-FNAC聯合BRAFV600E突變檢測(0.970)對ACR-TIRADS 4類結節的診斷效能優于單獨UG-FNAC(0.873)或BRAFV600E突變(0.778)，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。UG-FNAC聯合BRAFV600E突變檢測診斷TIRADS4a、4b、4c類結節的PPV、NPV、Se、Sp詳見表5，AUC分別為0.961(95%CI：0.925～0.996)、0.972(95%CI：0.946～0.972)、0.981(95%CI：0.956～1.000)。

表4 不同診斷方法對ACR-TIRADS4類結節的診斷價值

表5 UG-FNAC聯合BRAFV600E突變檢測對ACR-TIRADS4類不同亞分類結節的診斷價值

3 討 論

本研究471例TI-RADS4類結節中惡性結節占63.27%(298/471)，遠高于美國指南中的惡性風險，與我國指南推薦相似，其原因可能與研究人群選擇相關。惡性結節組的超聲檢查多呈低回聲、鈣化、縱橫比>1、形態不規則，但血供分布缺乏特征性改變，與之前指南推薦及回顧性研究相符，鈣化類型以點狀鈣化最多見(154/298)，血供分布以混合血管型最多、中央血供為主型次之、邊緣血管型最少。

TN是臨床常見病，檢出率隨超聲檢查的普及而增加，大部分為良性結節，惡性甲狀腺結節以PTC多見，TIRADS4類結節惡性風險頗具爭議[6]。471例ACR-TIRADS4類結節中，女性與男性之比為3.28∶1(361/110)，良性組與惡性組性別比例分別為3.12∶1和3.38∶1；惡性組結節的患病年齡低于良性組，平均年齡(42.2±10.8)歲，與Miao等[7]研究結果相似。在健康人群中篩查甲狀腺超聲造成的過度診斷增加了甲狀腺癌的發病率，其中以PTC增加更顯著，年輕人群可能更重視自身健康而提前了甲狀腺癌的發現時間，可能還與目前環境內分泌干擾物、工作節奏加快等因素相關[7-8]。本研究發現惡性組TSH水平高于良性組(P<0.05)。血清TSH水平升高可能通過誘導與甲狀腺癌不良預后相關的通路發生轉化而增加分化性甲狀腺癌的侵襲性[9]。

超聲檢查是評估TN惡性風險的最佳影像學檢查手段，具有無創、簡便、便于長期隨訪等優勢，但易受到操作者經驗的影響，2017年美國放射學會參照乳腺影像報告與數據系統的制定方法發表《ACR甲狀腺影像報告與數據系統白皮書》，采取積分制將結節分為ACR-TIRADS 1～5類，研究發現，從TIRADS 1～5類，惡性腫瘤的風險呈顯著上升趨勢，TIRADS4類結節的風險閾值評估為5%～20%之間，中華醫學會制定的2020中國TN超聲惡性危險分層指南即C-TIRADS中指出TI-RADS4類結節的惡性風險在2%～90%之間[2, 6]。因TI-RADS4類結節惡性風險不確定性高，對診斷干擾較大，有必要進一步完善檢查。

UG-FNAC是評估TN有效、經濟檢查方法，影響著TN的治療決策，直徑大于10 mm或侵犯頸部臨近血管、神經等解剖結構的TIRADS4類結節更建議綜合考慮風險與獲益后積極獲取細胞學病理[6]。相較于常規細胞學涂片檢查，TCT技術更好地保存細胞學標本，在UG-FNAC中廣泛應用。本研究中UG-FNAC診斷4類結節的PPV和Sp在98%以上，但Se、NPV不足80%，與廖麗燕等[10]研究結果相似，鄭斌等[11]研究則發現PPV、NPV、Sp和Se均可在90%以上，考慮與使用的超聲診斷分層方法差異有關，本研究與廖麗燕等[10]研究均采用ACR制定的TIRADS標準，鄭斌等[11]則是采用基于ACR的改良版TIRADS標準。由于受到穿刺結節的大小、質地、鈣化、鈣化形式以及操作者經驗和細胞病理學家的影響，有20%～30%不能通過細針穿刺活檢明確為良性或惡性[12]。本研究中Bethesda Ⅰ類和Ⅲ類結節占總穿刺標本的22.08%(104/471)，良性組和惡性組中Bethesda Ⅰ類和Ⅲ類結節在本組穿刺標本中占比分別為23.12%(40/173)和21.48%(64/298)。

血清學標記物(如血清胸苷激酶1、甲狀腺球蛋白、甲狀腺轉移因子1)、分子標記物(如BRAFV600E突變、RAS突變、RET/PTC重排)與甲狀腺惡性結節相關[13]。BRAF是MAPK信號通路的關鍵促進因子，在細胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，BRAFV600E突變是分化型甲狀腺癌尤其是PTC所特有的分子標記物，與PTC出現多灶性、淋巴結和甲狀腺外轉移及復發等不良預后相關。既往研究顯示，PTC中BRAFV600E突變的敏感性較低且與地區種族相關，高碘攝入的韓國超過80%，西方國家不足10%，中國人群突變率可達80%[14, 15]。本研究惡性組中BRAFV600E基因檢測為野生型者占43.29%(129/298)，約半數的惡性結節仍可能被漏診。本研究中BRAFV600E突變檢測診斷TN的PPV和Sp在95%以上，但NPV和Se不足60%，容易造成較高的漏診率。

由此可見，單獨應用UG-FNAC和BRAFV600E均會造成較高的漏診率。多項針對UG-FNAC細胞學不確定結節的研究表明，BRAFV600E突變檢測聯合UG-FNAC，可顯著提高診斷敏感性，并保持良好的特異性，盡管在FNA標本中存在假陰性或假陽性的BRAFV600E突變，并不影響對TN總體的輔助診斷效能，聯合應用仍可提高對惡性腫瘤的預測效能[16]。；韓英等[17]發現Bethesda系統聯合BRAFV600E檢測可使TN診斷的Se由不足70%提高到87.8%，NPV由60%左右提高到79.7%，Sp、PPV保持90%以上。本研究中UG-FNAC聯合BRAFV600E基因突變檢測的Se、NPV由不足80%分別提高到95.6%和92.9%，并保持非常好的Sp、PPV，充分保留了敏感度、陰性預測值與特異度、陽性預測值的互補作用。超聲評估的TIRADS4類結節的惡性風險范圍隨分級的增高而增加，4c類結節惡性風險范圍最大(21%～91.9%)[5]。譚興利等[18]研究UG-FNAC診斷4a、4b、4c類結節的Sp在90%左右，但Se僅80%左右。本研究UG-FNAC聯合BRAFV600E突變檢測診斷TIRADS4a、4b、4c的敏感度和特異度均在90%以上，計算AUC分別為0.961、0.972和0.981，對存在1項及以上可疑超聲特征的4類結節同時行細胞病理學檢查和BRAFV600E突變基因檢測可提高診斷效能。

綜上所述，TIRADS4類結節的惡性風險跨度大，采用TCT處理UG-FNAC標本聯合BRAFV600E突變檢測對ACR-TIRADS4類的不同亞類結節均具有較高診斷準確率，能夠有效地指導臨床醫生做出合理的治療方案，減少漏診和誤診。