KLF4調控TGF?β通路減弱EMT抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲及轉移

王寶金 徐麗達 趙欣欣 林少沖 李霞 杜俊鵬 王凱

鄭州大學第三附屬醫院1婦科，4小兒外科（鄭州450052）；2河南省卵巢惡性腫瘤國際聯合實驗室（鄭州450052）；3同濟大學附屬第一婦嬰保健院，轉化醫學研究中心（上海201204）

卵巢癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，發病率僅僅次于宮頸癌和子宮內膜癌［1］，病死率居女性生殖系統腫瘤的首位［2］。卵巢癌起病隱匿，術后易復發，缺乏有效的治療方法［3］。Krüppel樣因子4（Kruppel?like factor 4，KLF4）是一種參與調控上皮或者間充質基因的含鋅指轉錄因子，可調節細胞生長、增殖和分化等多種細胞過程［4］。KLF4 已被證實在多種癌癥中，包括胃癌［5］、乳腺癌［6］、前列腺癌［7］以及骨肉瘤［8］中起著抑癌基因的作用。然而，有研究表明［9］，在小細胞肺癌中KLF4促進癌細胞的增殖和化學抗性。本課題組前期研究表明［10］，在卵巢癌的發生發展中KLF4 扮演著抑制調節劑的作用。然而，其具體分子機制尚未明確。上皮細胞?間充質轉化（epithelial to mesenchymal cell transition，EMT）能有效地促進腫瘤的生長、耐藥性以及腫瘤的增殖。EMT 涉及多種不同的信號通路，TGF?β 信號通路為其中之一，且分為Smad 介導及非Smad 介導兩條途徑，其中最經典的途徑是由胞內信號轉導蛋白Smad 介導的TGF?β 信號轉導通路［11］。

目前，在卵巢癌的相關研究中KLF4 的作用及機制尚不明確，本研究通過慢病毒轉染建立KLF4過表達的SKOV3 細胞系，旨在探討KLF4 通過調控Smad 介導的TGF?β 通路減弱EMT 從而抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲及轉移，并通過建立原位小鼠移植瘤模型，驗證KLF4 在卵巢癌發生發展中的作用，為尋找卵巢癌的治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料卵巢癌細胞系SKOV3 購自美國菌種保存中心（ATCC）。胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone公司。N?cadherian 及E?cadherian 抗體均購于美國Cell signaling 公司；β?catenin、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）及二抗抗體均購于美國Santa Cruz 公司；Western blot 蛋白印跡電泳儀購于美國英杰公司；Western Blot 蛋白印跡轉膜儀購于美國伯樂公司；熒光顯微鏡購于日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及慢病毒轉染取對數生長期的

293FT 細胞進行傳代培養。將細胞分為KLF4 過表達組和空白對照組，KLF4 過表達組加入包裝好的過表達KLF4 病毒，空白對照組加入空載體熒光素酶病毒轉染SKOV3 細胞，轉染后用嘌呤霉素篩選，將穩定過表達KLF4 的細胞擴大培養，Western blot驗證KLF4 的表達。

1.2.2 MTT 實驗檢測卵巢癌細胞增殖能力的變化實驗組為已建立穩定KLF4 過表達的SKOV3細胞系，對照組為熒光素酶載體轉染的卵巢癌細胞，取對照組及實驗組對數生長期的細胞接種培養。不同時間點分別加入DMSO 試劑，避光孵育后檢測各孔的吸光度（波長為570 nm），統計結果并分析后制圖。

1.2.3 Transwell 實驗檢測卵巢癌細胞遷移及侵襲能力的變化取對數生長期的SKOV3 細胞，胰蛋白酶消化并重懸細胞并計數，取1 × 104個SKOV3細胞配置懸液后加入上室。侵襲實驗需要制備Transwell 小室內的基底膜：將Matrigel 稀釋并加入Transwell小室內基底層。下室均為含10%胎牛血清的DMEM 培養液，溫箱孵育細胞5 h 后取出Transwell小室，室溫下甲醇固定后結晶紫溶液染色（侵襲實驗用HE 染色），置于熒光倒置顯微鏡下拍照統計，比較細胞遷移、侵襲能力的變化。

1.2.4 Western blot 檢測EMT 及TGF?β 相關蛋白的表達取合適密度SKOV3 細胞提取細胞蛋白，測吸光光度值（在595 nm 波長下），同時計算各樣品的蛋白濃度及所加樣品的體積。加熱變性后冷卻，置于膠孔內，恒壓轉膜結束后封閉液封閉。孵育抗體后至于暗室曝光。掃描條帶，使用Image J對條帶進行灰度分析。

1.2.5 建立原位小鼠移植瘤模型驗證KLF4 過表達對腫瘤生長、轉移的影響將熒光素酶標記的KLF4 過表達SKOV3 細胞和對照組細胞原位注射至裸鼠卵巢包膜內，建立原位小鼠移植瘤模型，通過Xenogen 生物成像系統監測腫瘤的生長和轉移情況，每周一次持續8 周。

1.3 統計學方法實驗數據采用GraphPad Prism 7統計軟件進行分析。對實驗數據進行正態檢驗，服從正態分布的計量資料以均數±標準差表示，比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 在SKOV3 細胞中慢病毒載體介導KLF4過表達后細胞增殖能力降低采用MTT 法檢測24、48、72、96 h 細胞增殖情況，同一時間點與對照組相比，KLF4 過表達后細胞增殖水平明顯降低，差異有統計學意義（P< 0.05），說明KLF4 過表達后明顯抑制卵巢癌細胞的增殖。見圖1。

圖1 MTT 法檢測KLF4 過表達組與對照組細胞細胞增殖情況Fig.1 Cell proliferation of KLF4 overexpression group and control group was detected by MTT assay

2.2 在SKOV3 細胞中慢病毒載體介導KLF4 過表達后細胞侵襲、遷移能力降低采用細胞侵襲及遷移實驗分別檢測KLF4 過表達與對照組細胞的侵襲及遷移能力變化。結果顯示：與對照組相比，KLF4 過表達細胞系的細胞侵襲（圖2A）及遷移（圖2B）能力明顯下降，結果有統計學意義（P<0.001），說明KLF4 對卵巢癌細胞的侵襲及遷移能力起到抑制作用。見圖2。

圖2 KLF4 過表達組與對照組細胞遷移、侵襲能力變化Fig.2 Changes of cell migration and invasion ability between KLF4 overexpression group and control group

2.3 過表達KLF4 抑制卵巢癌細胞SKOV3 EMT相關蛋白的表達Western blot 結果顯示：與對照組相比，KLF4 過表達組細胞的EMT 相關間質標志物N?cadherin、β?catenin 表達降低，上皮標志物E?cadherin 表達升高（圖3），差異有統計學意義（P< 0.05）。表明過表達KLF4 能夠明顯抑制卵巢癌細胞的EMT 過程，即KLF4 可能通過抑制EMT過程從而抑制卵巢癌細胞的遷移、侵襲和轉移。見圖3。

圖3 Western blot 檢測SKOV3 細胞EMT 相關蛋白的表達Fig.3 Western blot detected the expression of EMT?related proteins in SKOV3 cells

2.4 卵巢癌細胞中過表達KLF4 抑制Smad 介導的TGF?β 通路Western blot 結果顯示，與對照組相比，KLF4 過表達組細胞P?Smad2 的表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P< 0.05），Total?Smad 2/3 的表達水平無明顯差異。提示KLF4 可能通過抑制Smad 介導的TGF?β 通路抑制卵巢癌細胞EMT。見圖4。

圖4 Western blot 分析比較KLF4 在不同時間點作用的SKOV3 細胞中p?SMAD2 及Total?SMAD2/3 的表達Fig.4 Western blot analysis and comparison of p?Smad2 and Total Smad2/3 expression in SKOV3 cells treated with KLF4 at different time points

2.5 KLF4 抑制原位小鼠卵巢癌移植瘤中原發性腫瘤生長和轉移動物成像結果顯示，與對照組相比，過表達KLF4組的腫瘤生長及轉移顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖5。

圖5 KLF4 過表達組與對照組小鼠原位卵巢癌腫瘤生長及轉移情況Fig.5 Growth and metastasis of orthotopic ovarian cancer in mice of KLF4 overexpression group and control group

3 討論

由于卵巢癌起病隱匿，超過75%的女性患者確診時已為晚期階段［12］。目前的研究表明，KLF4在不同的癌癥中起著不同的生物學作用［5-9］。筆者前期研究結果表明［10］，KLF4 在卵巢癌中起到抑癌基因的作用。本實驗通過MTT 及Transwell 實驗驗證了KLF4 過表達可以抑制卵巢癌的增殖、遷移及侵襲能力這一結論。然而KLF 具體的抑癌機制尚未明確，因此進一步探究KLF4 在卵巢癌中的具體分子作用機制。

EMT 是一個上皮細胞極性和細胞?細胞連接缺失，以及遷移和侵入性特性增加的過程，是腫瘤細胞發生遷移、侵襲的基礎［13］。近年來大量研究表明，KLF4 在不同的癌細胞中通過激活上皮細胞標記基因E?鈣黏蛋白（E?cadherin）的轉錄，調節EMT 從而達到抑制腫瘤細胞生長的目的［14］。同時EMT 參與多種信號通路轉導，其中包含TGF?β［15］、AKT［16］、Notch［17］、ERK1/2［18］及WNT/連環蛋白［19］等通路。轉化生長因子?β（TGF?β）是一種調節細胞增殖、遷移和分化的細胞因子，通過不同機制在不同細胞類型中觸發G1 期細胞周期停滯。在JIANG 等［20］研究中，通過TGF?β/Smad2 信號傳導途徑誘導EMT。基于上述研究，本實驗通過慢病毒載體轉染建立空白對照組和過表達KLF4 組，進行細胞功能學實驗并檢測EMT 相關蛋白的表達。

本研究結果表明：與對照組相比，KLF4 過表達的卵巢癌細胞中EMT 相關蛋白發生顯著變化；上皮細胞標志物E?cadherin 表達增加，間質細胞標志物N?鈣黏蛋白（N?cadherin）、β?連環蛋白（β?catenin）表達下降。研究表明，在EMT 的整個生物學過程中，伴有上皮標志物E?cadherin 表達下調以及N?cadherin、β?catenin 表達上調［21］，這些變化可導致細胞粘附力降低，極性喪失和緊密連接，從而促進腫瘤的遷移與侵襲。因此，過表達KLF4可通過抑制EMT，從而抑制與EMT 密切相關的卵巢癌細胞遷移侵襲的過程。本實驗中的細胞功能學實驗結果表明：KLF4 過表達可以抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力。同時，在本實驗建立的原位小鼠移植瘤模型中，與對照組相比，過表達KLF4 組的腫瘤生長及轉移顯著降低，進一步驗證了過表達KLF4 可以抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力。這將為卵巢癌的治療提供新的策略。

綜上所述，本研究通過探討KLF4 在卵巢癌中的作用及其作用機制，證明了KLF4 抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲是通過調控Smad 介導的TGF?β通路抑制EMT 實現的。有望成為卵巢癌診斷及治療的新靶點，為卵巢癌的治療提供新思路。然而目前的研究仍有不足，例如KLF4 在腫瘤的耐藥機制中起到何種作用以及KLF4 的上游基因調控機制等，仍需要進行進一步研究，以期為解決卵巢癌的耐藥特性提供新思路、為卵巢癌的治療提供新的依據。