胡桃醌抑制Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡減輕體外沖擊波導致的細胞損傷

田林強 來楓 張玥 王玉華 翁孝剛 董新文 姚三巧 任文杰

新鄉醫學院第三附屬醫院1創傷與骨科研究所，2泌尿外科（河南新鄉453003）；3新鄉醫學院公共衛生學院（河南新鄉453003）

瓦斯爆炸是煤礦安全生產的常見危害，素有煤礦安全生產“第一殺手”之稱，其造成的礦難次數和死亡人數在煤礦安全生產事故中均居首位［1-2］。瓦斯爆炸的主要致傷因素包括爆炸沖擊波損傷、高溫火焰燒傷和有毒有害氣體中毒以及繼發災害［3］。在瓦斯爆炸傷中，肺臟是最易受到損傷的器官［4-5］。筆者前期的研究發現，吸入高溫氣體和有毒有害氣體均會造成肺臟的損傷，并伴隨出凝血功能的障礙［6］。在肺損傷及其修復過程中，Ⅱ型肺泡上皮細胞均發揮重要的作用［7］。

研究表明，凝血異常會加重肺內炎癥反應，促進和加重肺損傷，而抗凝治療能夠減輕急性肺損傷的發生［8-9］。在顱腦損傷引起的肺損傷中，凝血功能障礙出現在急性肺損傷之前，說明其能夠誘導及加重急性肺損傷的發生［10］。筆者前期研究也發現，凝血異常在瓦斯爆炸傷害患者中常見，而且動物實驗也證實，瓦斯爆炸傷大鼠肺泡灌洗液中凝血酶?抗凝血酶Ⅲ活性明顯升高，說明凝血異常的存在［6］。肽基輔氨酰順反異構酶Pin1 能夠調控組織因子的轉錄和NF?κB的活性，進而加重肺組織的損傷［11］。在瓦斯爆炸所導致的肺損傷中，抑制Pin1是否抑制炎癥反應或凝血異常，從而改善肺功能，尚未見明確的報道。胡桃醌是胡桃楸和核桃中存在的活性物質，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物學活性［12］。其作為Pin1 的天然抑制劑，能夠抑制其促進腫瘤增殖和轉移等作用，但其在急性肺損傷中是否發揮作用以及發揮作用的機制尚不清楚。本研究通過建立體外沖擊波損傷的A549細胞模型，闡明胡桃醌的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器A549 細胞購自中國科學院上海細胞庫，DMEM/F12K 購自上海培源生物科技股份有限公司，胎牛血清、青?鏈霉素雙抗、胡桃醌購自Sigma 公司，CCK?8 溶液購自碧云天生物技術公司，IL?6、IL?8ELISA 試劑盒購自聯科生物。RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑購自博士德生物科技有限公司、caspase?3、caspase?9 及β?actin 抗體購自Cell Signal Technology。體外沖擊波碎石機為交大南洋JDPN?V 型，化學發光成像儀為上海勤翔6100 型，全波長讀數儀和CO2培養箱購自賽默飛。

1.2 細胞培養及沖擊波建模A549 用含10%胎牛血清、1%青?鏈霉素的DMEM/F12K 培養基在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。細胞融合到80% ~90%時，消化傳代，取對數生長期細胞用于后續實驗。根據文獻報道［12］，采用間接定位法確定體外沖擊波焦點，將含細胞懸液的離心管固定在涂有螯合劑的焦點處，13.7 kV 固定能量沖擊，探索最佳沖擊次數。

1.3 細胞增殖活性檢測將處理后的細胞以2 000個/孔的密度接種在96 孔板中，在沖擊后的24、48、72 h 檢測450 nm 處OD值，計算細胞生存率。細胞生存率=（實驗組OD值?空白組OD值）/（對照組OD值?空白組OD值）×100%。

1.4 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測炎性因子表達收集細胞上清液，300 g離心10 min去除沉淀，取上清，ELISA 試劑盒檢測IL?6、IL?8的含量。按說明書進行操作，測定450 nm 處的OD值。通過標準品濃度計算擬合曲線，根據公式計算檢測樣本濃度。

1.5 胡桃醌細胞毒性檢測及預處理將A549 細胞以5 000 個/孔密度接種在96 孔板中，細胞貼壁后，加入0.25、0.5、1、1.25 μg/mL 胡桃醌，加藥3、6、12、24 h 檢測細胞活力，獲得后續實驗的濃度和作用時間。

1.6 Western blot 檢測caspase?3 和caspase?9 蛋白變化棄去培養基，用預冷的PBS 清洗細胞后加入含廣譜蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解40 min，4 ℃、10 000 g 離心15 min，取上清。測蛋白濃度后加入上樣緩沖液，煮沸10 min，分裝備用。使用80 V 電壓在10% SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳至Marker 條帶分開，調整電壓為120 V，當染料到達凝膠底部停止電泳。300 mA 電流轉膜2 h，封閉90 min，一抗4℃孵育過夜。洗膜后，相應二抗室溫孵育1 h，再次洗膜后，滴加ECL 發光液，成像。

1.7 統計學方法所有數據均采用SPSS 25.0 進行數據分析，計量資料采用均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢測，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外超聲波處理導致細胞活性降低和炎癥因子表達增加，提示細胞模型制作成功通過不同次數體外沖擊波損傷后檢測細胞活力，發現其出現明顯的變化，見圖1。細胞經過1 000 次沖擊后培養24 h，細胞活力降至（49.2 ± 3.04）%，48 h 和72 h 有所回升，探究沖擊波損傷的機制，因此采用沖擊1 000 次、培養24 h 作為后續的實驗條件。同時發現體外沖擊波沖擊1 000 次后細胞上清中IL?6 和IL?8 的水平分別為（55.6 ± 0.4）pg/mL 和（1 480.3 ± 19.1）pg/mL，均較正常對照組增加，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

圖1 不同次數沖擊波損傷后不同時間點A549 細胞活力的改變Fig.1 Cell viability of A549 cells was detected by CCK?8 at different time after exposed to various times of shockwaves injury

圖2 胡桃醌預處理能夠降低經過沖擊波處理的A549 細胞上清液中IL?6 和IL?8 含量Fig.2 Pre?treatment with Juglone，the concentration of IL?6 and IL?8 in the supernatants was decreased after 1 000 times shockwaves injury

2.2 胡桃醌能夠改善沖擊波導致的細胞活力下降通過細胞毒性實驗發現，胡桃醌在0.5 μg/mL濃度作用A549細胞6 h后，對細胞活力沒有明顯影響，因此采用這一濃度進行后續實驗，見圖3。A549 細胞經過0.5 μg/mL 的胡桃醌預處理6 h 后，進行沖擊波處理，隨后檢測細胞活力，發現沖擊波損傷組（shockwave group，SW）細胞活力為（52.5 ± 0.9）%，胡桃醌預處理組（shockwave+Juglone group，SW+Jug）細胞活力為（70.1±3.1）%，差異有統計學意義（P<0.05），見圖4，說明胡桃醌對細胞有保護作用。

圖3 不同濃度胡桃醌處理不同時間后A549 細胞活力Fig.3 Cell viability of A549 was detected by CCK?8 at different time after exposed to various concentration of Juglone

圖4 胡桃醌預處理A549 細胞能夠提高體外沖擊波損傷后的細胞活力，降低沖擊波對細胞的損傷Fig.4 A549 cells were pre?treated with 0.5ug/ml Juglone for 6h，then exposed to 1 000 times shockwaves，the cell viability was increased

2.3 胡桃醌能夠抑制體外沖擊波導致A549 細胞炎癥因子釋放為了檢測胡桃醌對體外沖擊波導致的A549 細胞炎癥反應的影響，收集體外沖擊波損傷后24 h 的細胞上清，檢測IL?6、IL?8 的表達。結果發現，和沖擊波損傷組（shock wave group，SW）相比，胡桃醌預處理組（shock wave + Juglone group，SW+Jug）IL?6、IL?8 的表達量分別為（37.3±1.2）pg/mL 和（1 281.9± 17.3）pg/mL，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2，說明胡桃醌能夠抑制沖擊波導致的炎癥反應，從而減輕細胞損傷。

2.4 胡桃醌能夠抑制caspase?3 和caspase?9 的表達在體外沖擊波導致的肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷中發現，caspase?3 和caspase?9 的表達量明顯升高，說明也存在細胞凋亡。加入胡桃醌后，其能夠抑制caspase?3、和caspase?9 的表達，說明能夠抑制細胞凋亡，從而減輕上皮細胞的損傷，為后期肺功能的恢復提供條件，見圖5。

圖5 胡桃醌預處理能夠降低caspase?3 和caspase?9 的表達量Fig.5 Caspase?3 and caspase?9 protein level were decreased by pretreated with julgone and exposed to 1000 times shockwave injury

3 討論

本研究發現胡桃醌能夠減輕沖擊波造成的細胞損傷，提高細胞活力，減少IL?6 和IL?8 的釋放，降低caspase?3 和caspase?9 蛋白表達水平，抑制肺泡上皮細胞凋亡［13］，從而減少沖擊波造成的損害，發揮保護作用，有成為臨床治療肺損傷用藥的可能。

肺爆震傷的發生機制尚未明確，沖擊波在其中發揮重要作用。沖擊波對生物體的作用包括峭化?撕裂效應、空化?內爆效應、空化?生化效應和非熱效應，產生修復、血管生成和擴張、解痙及鎮痛作用［14］。在低能量情況下，沖擊波能夠促進ARDS大鼠肺內線粒體轉移至特定細胞，發揮減輕炎癥反應和降低損傷的作用［15］。但高能量的沖擊波能夠造成肺組織內血液滲漏、炎癥反應增加，活性氧簇表達增高和細胞凋亡增加，其中caspase?3蛋白和mRNA的表達水平均明顯增高［16-17］。炎性小體激活和炎癥反應在急性肺損傷中發揮了重要的作用［18］。本研究發現，使用過量的沖擊波刺激，會導致肺泡上皮細胞炎性因子表達升高，caspase?3和caspase?9蛋白表達升高，發生細胞凋亡。

Pin1 在炎癥反應和腫瘤發生中均發揮重要作用［19］，在小腸缺血?再灌注損傷中，抑制Pin1 能夠抑制炎癥反應，減輕損傷［20］。胡桃醌作為Pin1 的天然抑制劑，具有抗炎、抗菌及抗腫瘤生物學活性。胡桃醌在濃度低于10 μmol/L 時對單核巨噬細胞沒有明顯毒性作用［21］。本研究采用的濃度低于此濃度，發現其作用6 h 對A549 細胞沒有明顯的損傷。胡桃醌能夠抑制脂多糖誘導的巨噬細胞炎性小體的激活，從而抑制炎癥反應的發生，發揮抗炎的作用［21］。這和本研究結果相一致。

雖然本研究發現胡桃醌能夠抑制沖擊波造成的A549 細胞損傷，但是僅進行了體外細胞的實驗，沒有在沖擊波肺損傷動物體內進行驗證，而且對損傷的機制研究也不夠深入，這是本研究的不足，也是下一步要研究的內容。