外泌體源性miR?939靶向ADCY6調控缺氧誘導的心肌細胞損傷

鐘育武 趙展慶

海南西部中心醫院1急診科，2重癥醫學科（海南儋州571700）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是指因冠狀動脈不穩定、血栓形成、心肌壞死而引起的嚴重心肌急性持續性缺血缺氧［1］。外泌體（exosome，exo）是由細胞分泌到胞外的直徑為30~200 nm的小囊泡，該囊泡中含有多種蛋白質與核酸，作為媒介參與細胞之間的信號傳遞［2］。exo 近些年來被認為是極具潛力的生物診斷標志物，被應用于多種疾病的診斷與治療中［3］。先前研究表明心肌結節病與AMI 患者循環exo 中miR?NA 的表達具有差異，提示exo 源性miRNA 可作為疾病的生物標志物［4］。有研究發現血清exo 分泌miR?939?5p 在心肌缺血中參與調控血管生成［5］，miR?939?5p 在AMI 中的表達較健康對照組顯著降低［6］，但是miR?939 在AMI 中發揮作用的具體機制未被揭示。腺苷酸環化酶6（ADCY6）是一種磷酸酶，主要分布于細胞質膜、細胞核膜、內質網膜上，可將ATP轉變成為cAMP，引起細胞的信號應答［7-8］。據報道，腎上腺素通過轉錄因子CREB1 上調心臟中CIRC?HIPK3 進而增加ADCY6 的表達，下調ADCY6 可以減輕小鼠心肌梗死后的心肌纖維化，并維持心功能［9］。

本研究通過建立缺氧誘導的心肌細胞模型與AMI 大鼠模型，分離正常心肌細胞exo，干預exo 中miR?939 表達，對AMI 細胞模型與大鼠模型進行exo 治療，探討exo 源性miR?939 在AMI 中的具體作用機制，為AMI 的診斷與治療尋找潛在的生物標志物。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材H9C2 細胞（中國科學院上海生物科學研究所細胞庫）。HEK293 細胞（湖南豐暉生物科技有限公司）。SD 大鼠（江蘇艾菱菲生物科技有限公司）。血清外泌體提取試劑盒（北京全式金生物）。細胞外泌體提取試劑盒（武漢華美生物）。二氯化鈷（Sigma?Aldrich）。MTT 檢測試劑盒（上海翊圣）。Lipofectamine 3000 轉染試劑、PVDF膜、RPMI?1640 培養基、cDNA 合成試劑盒、Applied Biosystems 實時熒光定量PCR 儀、化學增強發光試劑、雙熒光素酶檢測試劑盒（Thermo Fisher）。pcD?NA 質粒與miRNA 模擬體、抑制劑（上海吉瑪基因）。qRT?PCR 引物序列由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成。放射免疫沉淀裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、TTC 染色液（南京森貝伽生物）。抗體均購自Abcam公司。結晶紫、Annexin V?FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶）。外泌體轉染試劑（上海覓拓生物）。FV3000 激光共聚焦顯微鏡（Copyright）。CytoFLEX 流式細胞儀（Beck?man Coulter）。Vevo 2100 超聲機（VisualSonics）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析基因表達數據庫（GEO）中搜索關于AMI芯片并進行分析。TargetScan（http：//targetscan.org/vert_72/）獲取miR?939 的靶基因。

1.2.2 血清收集收集2019年8月至2020年8月我院收治的52 例AMI 患者的血漿（男32 例，女20 例，平均年齡49.5 歲），健康人的血漿從體檢人群中進行收集，取材前均簽署書面知情同意書。將血漿3 000×g離心30 min，得到血清。本研究經海南西部中心醫院倫理委員會批準。

1.2.3 外泌體分離與鑒定血清中外泌體使用血清外泌體提取試劑盒分離并純化。細胞中外泌體的提取則使用CUSABIO 外泌體提取試劑盒來完成，具體步驟依據試劑盒說明書進行。透射電子顯微鏡觀察外泌體，Western blot 檢測exo 標志物CD9、CD81、CD63。

1.2.4 缺氧細胞模型的建立與分組H9C2 細胞接種于96 孔培養板，1.5×104個/孔，添加10%胎牛血清的DMEM 培養基進行培養，加入二氯化鈷（CoCl2）用于建立缺氧心肌細胞模型。H9C2細胞被分為8 組：Control 組（常氧H9C2 細胞）、hypoxic 組（CoCl2處理的H9C2細胞）、exo組（CoCl2?H9C2+exo）、exo+NC 組（CoCl2?H9C2+exo?NC）、exo+inh?miR?939組（CoCl2?H9C2+exo+inh?miR?939）、exo+miR?939 組（CoCl2?H9C2+ exo+miR?939）、exo+miR?939+pcDNA組（CoCl2?H9C2+exo+miR?939+pcDNA）、exo+miR?939+ADCY6 組（CoCl2?H9C2+exo+miR?939+AD?CY6）。在轉染前1 天將H9C2 細胞接種于6 孔培養板中，每孔5 × 104個，第二天使用Lipofectamine 3000 轉染試劑進行轉染，24 h 后進行下一步實驗。

1.2.5 exo 與H9C2 細胞的共培養H9C2 細胞缺氧培養4 h 后，與正常H9C2 細胞共培養，未進行共培養的缺氧H9C2 細胞作為對照組。使用qRT?PCR 檢測miR?939 的表達情況。

1.2.6 3?（4，5?二甲基噻唑?2?基）?2，5?二苯基四唑溴化銨（MTT）法將細胞制成單個細胞懸液，接種于96 孔培養板，5 × 103個/孔，在37℃、5%CO2的培養箱中培養24 h 后向孔板中加入MTT 工作液，每孔10 μL，放置在培養箱中4 h。加入甲臜溶解液，100 μL/孔。培養4 h 后使用酶標儀測定光密度值。

1.2.7 蛋白質印跡分析（Western blot）細胞與exo使用放射免疫沉淀裂解液進行裂解，吸取上清液使用BCA 蛋白定量試劑盒定量。行SDS?PAGE 凝膠電泳，在90 mA 時將蛋白轉移到PVDF 膜上。5%脫脂牛乳將膜封閉，在膜上加入一抗CD9（1∶2 000）、CD81（1∶1 000）、CD63（1∶1 000）、GM130（1∶1 000）、ADCY6（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃下過夜孵育。第二天使用辣根過氧化物酶偶聯的二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000）室溫下孵育1 h。使用化學增強發光試劑顯影，并在Bio?Rad 數字圖像系統上對蛋白進行分析。

1.2.8 Transwell 分析胰蛋白酶處理細胞，并懸浮于RPMI?1640 培養基中，調整為3 × 105個/mL，在上腔室加入200 μL細胞，下腔室加入含有20%胎牛血清的600 μL 培養基，放于培養箱中培養24 h。使用棉簽擦拭細胞。PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定10 min，結晶紫染色8 min，在顯微鏡下拍照觀察細胞并對遷移細胞進行計數。

1.2.9 流式細胞術收集細胞并根據Annexin V?FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書的要求對細胞進行染色，借助流式細胞儀檢測觀察細胞凋亡情況，并計算細胞凋亡率。

1.2.10 雙熒光素酶報告基因分析構建含有miR?939 結合序列的ADCY6 野生型（ADCY6?WT）與突變型（ADCY6?MUT）質粒，將以上質粒分別與miR?939 NC、miR?939 mimic 共轉染到HEK293 細胞中，按照Lipofectamine 3000 轉染試劑的出廠商要求進行轉染，48 h 后收集細胞進行裂解，應用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測每組細胞的熒光素酶活性，檢測過程按照試劑盒要求進行。

1.2.11 qRT?PCR將細胞樣本中的總RNA 使用Trizol 試劑進行提取，并測定RNA 的濃度與純度。利用反轉錄試劑盒將RNA 合成cDNA，mRNA 的表達使用SYBR?PCR 混合試劑與Applied Biosystems實時熒光定量PCR 儀進行分析，以上所有檢測步驟均按照試劑盒說明書進行。miR?939 以U6 作為參考，ADCY6 以GAPDH 為參考。2?ΔΔCT法計算相對表達量。

1.3 統計學方法本研究應用SPSS 22.0 軟件進行數據分析，數據使用均數±標準差表示。數據是否屬于正態分布應用Kolmogorov Smirnov 檢驗，兩組間數據采用t檢驗進行比較，多組間數據采用單因素方差分析進行比較，兩兩數據比較采用Sidak 檢驗或Tukey 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR?939 在AMI 樣本中表達降低GSE34571數據集顯示與未接受治療降低患者相比，miR?939在治療后的患者中表達顯著降低。qRT?PCR 實驗發現與健康人血清相比，AMI 患者血清中miR?939表達降低（圖1A，P< 0.05）。與正常H9C2 細胞相比，缺氧H9C2 細胞中miR?939 表達降低（圖1B，P< 0.05）。另外發現較健康人血清外泌體，AMI患者血清外泌體中miR?939 表達顯著降低（圖1C，P< 0.05）。說明miR?939 可能在AMI 的發展中發揮作用。

圖1 miR?939 在AMI 樣本中表達降低Fig.1 The expression of miR?939 was decreased in AMI samples

2.2 exo可攜帶miR?939進入H9C2細胞使用透射電子顯微鏡觀察exo 顯示為杯狀或球行狀，直徑在40 ~ 100 nm（圖2A）。Western blot 實驗發現CD9、CD81、CD63 過表達，而GM130 不表達（圖2B），exo被成功提取。正常H9C2 細胞與缺氧H9C2 細胞共培養后，缺氧H9C2 細胞中miR?939 表達顯著上升，而加入外泌體抑制劑GW4869 后miR?939 的表達部分降低（均P<0.05，圖2C），說明miR?939可能由正常H9C2細胞分泌exo包裹進入缺氧H9C2細胞。

圖2 exo 攜帶miR?939 進入H9C2 細胞Fig.2 Exo carries miR?939 into H9C2 cells

2.3 正常H9C2細胞分泌的exo攜帶miR?939可減輕缺氧心肌細胞損傷與Control 組相比，hypoxic組細胞活力與遷移均降低，凋亡率上升（均P<0.05）。與hypoxic組相比，exo組H9C2細胞的活力與遷移均增加，而細胞凋亡率降低（均P<0.05）。與exo+NC組相比，exo+inh?miR?939 組的H9C2 細胞的活力與遷移均減少，并且細胞凋亡率上升（均P<0.05，圖3）。

圖3 miR?939 可減輕缺氧心肌細胞損傷Fig.3 miR?939 reduced hypoxic cardiomyocyte damage

2.4 miR?939和ADCY6存在靶向關系借助Target Scan 預測和miR?939 特異性結合位點的靶點，結果顯示ADCY6 和miR?939 存在特異性結合位點，雙熒光素酶報告實驗進一步驗證了二者間的靶向關系（圖4A）。檢測正常和AMI患者血清中ADCY6的表達結果顯示，AMI 患者血清中ADCY6 的表達顯著增強（圖4B）。與正常H9C2 細胞相比，缺氧的H9C2 細胞中ADCY6 的mRNA 與蛋白表達均提高（均P<0.05，圖4C）。

圖4 ADCY6 是miR?939 的一個靶點Fig.4 ADCY6 was a target gene of miR?939

2.5 ADCY6 可部分抵消miR?939 對缺氧心肌細胞的保護作用與hypoxic 組相比，exo 組的細胞活力與遷移均上升，凋亡率下降，而與exo?NC 組相比，exo+miR?939 組的細胞活力與遷移均有所提高，凋亡率下降，與exo+miR?939+pcDNA 組相比，exo+miR?939+ADCY6 組中細胞的活力與遷移均下降，而細胞凋亡率有所上升（均P<0.05，圖5）。

圖5 ADCY6 可部分抵消miR?939 對缺氧心肌細胞的保護作用Fig.5 The protective effect of miR?939 on hypoxic cardiomyocytes was partially offset by ADCY6

3 討論

多項研究發現miRNA 可由exo 包裹攜帶進入細胞發揮功能，而exo 中存在的miRNA 與血液中存在的miRNA 的表達具有差異，所以有必要對exo中的miRNA 進行研究［10?12］。本研究通過一系列實驗研究exo 及分泌的miR?939 在AMI 中的潛在作用機制。

首先分析GEO 數據庫中名為GSE34571 的芯片。該芯片顯示AMI 患者接受治療后的心室舒張末期容積（LVEDV）顯著低于治療前［13］，該芯片數據顯示miR?939 在治療后的患者中表達顯著升高，之前有研究證明miR?939?5p 在AMI 患者中顯著下調［6］，本研究證實miR?939在AMI患者中表達較健康人下調。有研究發現miR?939可來源于血清exo［14］，本研究分離血清exo，發現在AMI 患者的血清外泌體中miR?939 表達顯著降低。為進一步確認miR?939 外泌體來源的細胞，本研究在正常心肌細胞中分離外泌體，與缺氧心肌細胞共培養發現缺氧心肌細胞中miR?939 的表達上調，GW4869 能部分抑制該作用，進一步證實正常心肌細胞分泌的外泌體作為傳遞miR?939 的介質。

另外本研究發現exo 對缺氧心肌細胞具有保護作用，敲減exo 中miR?939 的表達可以降低exo對缺氧心肌細胞的保護作用，說明exo 可能是通過分泌miR?939 來發揮作用。據報道LncRNA Rp4 可通過下調miR?939 加重缺氧心肌細胞的損傷［15］。血清exo 通過miR?939?iNOS?NO 途徑促進心肌缺血患者的血管形成。而本研究針對miR?939 對缺氧心肌細胞的功能進行探討。研究顯示exo 可以促進心肌細胞的增殖、遷移，并抑制細胞凋亡，對缺氧心肌細胞起到保護作用，并且在exo 中過表達miR?939 比單獨使用exo 的治療效果更顯著。而敲減exo 中miR?939 的表達使exo 對缺氧心肌細胞的保護作用大打折扣，進一步證實exo 是通過分泌miR?939 發揮心肌保護作用。此外，本研究證實miR?939 可以靶向ADCY6，過表達ADCY6 可部分抵消過表達miR?939 對缺氧心肌細胞的保護作用，有研究顯示敲除CircSLc8a1 可通過miR?133a 下調ADCY6 來減輕壓力超負荷所致的心肌肥厚［16］。YANG 等［17］通過PPI 網絡分析在心肌細胞中發現6 個與心臟病相關的新基因其中就包括ADCY6。miR?182 通過降低ADCY6 的表達來調節心肌肥厚小鼠的心肌肥大反應［18］。在體內exo 可以提高AMI大鼠的LVEF 和LVFS，并減少心肌梗死面積。而在AMI 大鼠中轉染敲減miR?939 的exo 后，exo 的治療作用被部分抑制。

本次研究僅僅觀察對心肌細胞產生的作用，AMI 的發病過程中仍有其他細胞在參與，如內皮細胞。所以還需要大量研究進一步驗證本次研究結果并在臨床中實現利用價值。

綜上所述，證實exo 分泌的miR?939 可以通過下調ADCY6 減輕缺氧心肌細胞的損傷，保護AMI的心肌功能，為AMI 的預防與治療提供了新的分子靶點。