南極磷蝦油亞臨界萃取工藝優(yōu)化及揮發(fā)性成分分析

孫德偉 謝 強(qiáng) 李進(jìn)偉 劉元法

(1.無錫商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 無錫 214153；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122；4.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

南極磷蝦油主要成分有ω-3多不飽和脂肪酸、磷脂、蝦青素、維生素E等生物活性物質(zhì)[1]，其中磷脂型ω-3多不飽和脂肪酸占總脂肪酸的34%[2-3]，被譽(yù)為海洋卵磷脂[4]。當(dāng)前，制備南極磷蝦油主要采用溶劑提取和無溶劑提取兩類[5-6]。采用溶劑制備南極磷蝦油，通常選用丙酮、乙醇或正己烷等單一溶劑，但存在耗費(fèi)時(shí)間長、效率低、溶劑殘留及原料中部分生物活性成分易失活等弊端；也有先丙酮后乙醇兩步溶劑法制備南極磷蝦油的報(bào)道[7-8]，但兩步法也存在耗時(shí)長、產(chǎn)物脫溶分離成本高等問題；采用超臨界CO2夾帶20%乙醇制備南極磷蝦油，但需先對(duì)南極磷蝦進(jìn)行脫水干燥，干燥過程中的高溫會(huì)破壞南極磷蝦中的熱敏成分[4，8]；采用超臨界流體提取技術(shù)制備南極磷蝦油，但超臨界制備設(shè)備構(gòu)造復(fù)雜、維護(hù)使用成本較高[9-10]。無溶劑提取酶法也被用于南極磷蝦油的制備[11-12]，但專用酶的價(jià)格昂貴限制了其在脂質(zhì)制備中的規(guī)模化應(yīng)用，且提取水環(huán)境中磷脂乳化也會(huì)降低其提取率。基于此，當(dāng)前亟需一種經(jīng)濟(jì)、污染小且能夠最大限度保存南極磷蝦油生物活性物質(zhì)的制備方法。

亞臨界流體提取技術(shù)具有工作壓力低、工作溫度相對(duì)較低、綜合效率較高、總體投資和運(yùn)行成本相對(duì)較低等優(yōu)勢(shì)，在一些特種植物油[13-14]和特種動(dòng)物脂的分離制備中被小規(guī)模化應(yīng)用[15-16]。部分學(xué)者[17-18]研究了亞臨界萃取南極磷蝦油技術(shù)，Xie等[19]系統(tǒng)研究了多種溶劑分離制備南極磷蝦油，涉及到亞臨界丁烷制備南極磷蝦油，但該研究采用了亞臨界丁烷分離小麥胚芽油的條件[20]。文章擬選擇亞臨界流體提取技術(shù)提取南極磷蝦油，并對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為南極磷蝦油綠色工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料及設(shè)備

南極磷蝦粉：含水(9.0±0.5)%，-40 ℃保存?zhèn)溆茫|漁集團(tuán)有限公司；

試驗(yàn)試劑：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

亞臨界提取裝置：BE-5L型，河南亞臨界生物技術(shù)有限公司；

高效液相色譜：1260型，配備蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國安捷倫科技公司；

氣相色譜：7820A型，美國安捷倫科技公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R205D型，無錫申科儀器廠；

離心機(jī)：5810型，德國艾門德公司；

pH計(jì)：FE28型，瑞士梅特勒—托利多公司；

分析天平：ME104E型，瑞士梅特勒—托利多公司；

磁力攪拌器：VORTEX 1型，德國IKA公司；

震蕩搖床：CHA-S型，金壇榮華儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 南極磷蝦油分離 將500 g南極磷蝦粉用布袋封口放入提取罐，抽真空。按料液比(m南極磷蝦粉∶V丁烷)1∶5(g/mL)將亞臨界溶劑丁烷泵入提取罐，外套熱水循環(huán)控制提取溫度，設(shè)定條件提取完成后將提取混合液導(dǎo)入分離罐減壓蒸發(fā)分離產(chǎn)物。多次提取后合并提取物，離心過濾稱重，并按式(1)計(jì)算南極磷蝦油提取率。

(1)

式中：

m1——單位質(zhì)量原料按試驗(yàn)方法制備的油的質(zhì)量，g；

m0——單位質(zhì)量原料按Folch方法[21]制備脂質(zhì)的質(zhì)量，g；

N——南極磷蝦油提取率，%。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化南極磷蝦油提取工藝 在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、提取溫度和提取壓力為考察因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，以南極磷蝦提取率為響應(yīng)值優(yōu)化南極磷蝦油的亞臨界制備工藝條件。

1.2.3 南極磷蝦油揮發(fā)性成分分析 采用頂空固相微萃取和氣相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜(HS-SPME-GC-MS)檢測(cè)南極磷蝦油揮發(fā)性成分。取南極磷蝦油10.0 g封閉于25 mL頂空瓶中，以封口膜密封。

(1)HS-SPME過程：對(duì)固相萃取柱(DVB/CAR/PDMS, 50/30 μm)進(jìn)行預(yù)處理，將萃取裝置上萃取柱插入GC進(jìn)樣口，270 ℃老化30 min，載氣為氦氣，流量1.0 mL/min；將萃取柱插入裝有待測(cè)樣品的頂空瓶上層，70 ℃震蕩吸附30 min，隨即將萃取柱插入GC進(jìn)樣口，250 ℃解吸5 min后進(jìn)行GC/MS分析。

(2)GC/MS分析：GC條件為HP-5MS毛細(xì)管柱(長30 m，內(nèi)徑0.25 mm)，載氣為99.99%氮?dú)猓魉?.0 mL/min；程序升溫為45 ℃保持2 min，以3 ℃/min升至130 ℃，10 ℃/min升至240 ℃保持8 min；MS條件為電子轟擊離子源，離子源溫度250 ℃，電子能量70 eV，碎片掃描范圍32～560(m/z)。未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)譜圖庫NIST、WILEY檢索定性分析，根據(jù)相對(duì)峰面積定量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用同批次原料重復(fù)3次，使用SPSS 18.0軟件分析方差(ANOVA)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞臨界分離南極磷蝦油工藝優(yōu)化

2.1.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 選取提取時(shí)間、提取溫度和提取壓力為主要因素，以提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

2.1.2 模型的建立及方程分析 利用Design-Expert 7.0軟件對(duì)表2中的響應(yīng)值與各因素進(jìn)行多元回歸分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

(2)

表3 回歸模型方差分析?

2.1.3 響應(yīng)面分析 由圖1可知，隨著提取時(shí)間的延長，提取率呈升高趨勢(shì)，前段升高快，后期升高平緩。隨著提取溫度的上升，提取率呈先增高后稍有下降趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為40～50 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最高。

圖1 提取時(shí)間和提取溫度對(duì)提取率的交互作用

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長，提取率總體呈升高趨勢(shì)，前段升高快，后期升高平緩。隨著提取壓力的上升，提取率呈緩慢上升趨勢(shì)。

圖2 提取時(shí)間和提取壓力對(duì)提取率的交互作用

由圖3可知，隨著提取溫度的上升，提取率呈先升高后降低趨勢(shì)。而隨著提取壓力的上升，提取率呈緩慢上升趨勢(shì)。

圖3 提取溫度和提取壓力對(duì)提取率的交互作用

2.1.4 回歸模型驗(yàn)證 根據(jù)回歸模型計(jì)算得到亞臨界丁烷制備南極磷蝦油最佳工藝條件為提取時(shí)間132.74 min，提取溫度42.07 ℃，提取壓力1.08 MPa，南極磷蝦油最高提取率可達(dá)81.95%。結(jié)合實(shí)際操作，將工藝條件修正為提取時(shí)間120 min，提取溫度40 ℃，提取壓力1.0 MPa，為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得南極磷蝦油提取率為(81.2±0.4)%，與預(yù)測(cè)值接近，說明二次回歸方程模型合理，試驗(yàn)結(jié)果較理想。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)條件與邢要非等[23]亞臨界丁烷制備棉籽油、劉日斌等[24]亞臨界丁烷制備芝麻油、馬燕等[25]亞臨界丁烷制備杏仁油的提取條件較為相近，且其亞臨界提取溫度略有降低，這有利于動(dòng)物性原料中熱敏性成分的保護(hù)。此外，亞臨界丁烷最佳提取時(shí)間的差異可能與原料性質(zhì)有關(guān)，如芝麻油和杏仁油為植物來源原料。

2.2 南極磷蝦油揮發(fā)性成分

為進(jìn)一步研究亞臨界丁烷準(zhǔn)備南極磷蝦油的性質(zhì)，采用頂空固相微萃取和氣相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜(HS-SPME-GC-MS/MS)檢測(cè)亞臨界丁烷制備的南極磷蝦油揮發(fā)性成分，其總離子流圖如圖4所示。

圖4 南極磷蝦油揮發(fā)物GC-MS總離子流圖

經(jīng)NIST、Wiley2008譜庫串聯(lián)檢索，共檢出醛類、酸類、烴類等化合物，其保留時(shí)間、化合物名稱及相對(duì)峰面積見表4。

由表4可知，南極磷蝦油主要揮發(fā)性成分有27種，其中2-癸烯醛、11-烯醛、癸酸為主要成分。丁浩宸等[26-27]發(fā)現(xiàn)，醚類、醛類是整蝦的關(guān)鍵揮發(fā)性成分，其中頭胸部的揮發(fā)性成分主要是(E,Z)-2,6-壬二烯醛、3-甲硫基丙醛、3-甲基丁醛、壬醛、苯乙醛、D-檸檬烯、(Z)-4-庚烯醛、二甲基硫醚、辛醛、苯甲醛，腹部揮發(fā)性物質(zhì)主要是二甲基三硫醚、癸醛、壬醛、3-甲基丁醛、辛醛、D-檸檬烯、二甲基硫醚、(Z)-4-庚烯醛。Giogios等[28]發(fā)現(xiàn)蝦粉和蝦油揮發(fā)性物質(zhì)不同，包括蝦油在內(nèi)的海洋油脂揮發(fā)性物質(zhì)有較高含量的乙基呋喃、2-亞甲基丁基環(huán)丙烷、己醛、2,4-辛二烷、3,5-辛二烷；而蝦粉中揮發(fā)性物質(zhì)幾乎檢測(cè)不到不飽和環(huán)烴和萜類，呋喃含量較低。而南極磷蝦油揮發(fā)性物質(zhì)中也幾乎不含不飽和環(huán)烴類和萜類，其呋喃含量也較低，總體組成與文獻(xiàn)[26-28]基本一致，但具體含量有一定差別，可能是由于原料差異所致。綜上，南極磷蝦油中揮發(fā)性成分組成不如其脂肪酸具有穩(wěn)定的組成和含量，但也能作為南極磷蝦油真?zhèn)舞b定的一個(gè)特征性指標(biāo)。

表4 揮發(fā)性組分組成及相對(duì)含量

3 結(jié)論

以南極磷蝦粉為原料，采用亞臨界丁烷分離制備南極磷蝦油。結(jié)果表明，南極磷蝦油的最佳亞臨界制備工藝為提取溫度40 ℃，提取壓力1.0 MPa，提取時(shí)間120 min，此時(shí)南極磷蝦油提取率為(81.2±0.4)%。頂空固相微萃取和氣相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜分析表明，該南極磷蝦油揮發(fā)性成分主要為2-癸烯醛、11-烯醛、癸酸等27種，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)南極磷蝦油中揮發(fā)性成分組成可以作為南極磷蝦油真?zhèn)舞b定的一個(gè)特征性指標(biāo)。后續(xù)可研究南極磷蝦油的特殊性質(zhì)。