基于高通量測序分析西藏沙棘根瘤內生菌的多樣性

張愛梅,殷一然,孔維寶,朱學泰,孫 坤

西北師范大學生命科學學院, 蘭州 730070

非豆科植物西藏沙棘(Hippophaetibetana)是一種典型的放線菌結瘤植物[1],其根部也能形成根瘤,西藏沙棘的根瘤在形態結構和發育特點方面均與豆科植物和根瘤菌形成的根瘤不同[2-3],西藏沙棘根瘤內的共生微生物主要是能夠固氮的放線菌弗蘭克氏菌(Frankiaspp.)。對于沙棘屬植物根瘤內弗蘭克氏菌的研究,早在1982年Burggraaf等[4]就從沙棘根瘤中分離到弗蘭克氏菌的純培養物,之后研究者也對沙棘根瘤內生弗蘭克氏菌進行了分離培養[5-6]、生理生化特征分析[7]、分子特性[8]以及不同生境及不同寄主植物來源多樣性[7-8]等方面的研究。對沙棘屬植物不同種類來說,國內外也有學者開展了對柳葉沙棘[9]、蒙古沙棘[10]、中國沙棘[8, 11]、大果沙棘[12]等的弗蘭克氏菌的相關研究工作,研究內容涉及沙棘弗蘭克氏菌形態觀察、結瘤機理、分離回接等[1, 13]。所有這些研究大都是基于要從沙棘屬植物中分離得到弗蘭克氏菌的純培養而開展的相關工作,在這些研究中,對弗蘭克氏菌多樣性研究,是研究者關注的一個熱點,但由于弗蘭克氏菌離體培養的難度較大,實驗室條件下提供的培養基及培養環境與弗蘭克氏菌所處的自然環境之間存在很大差異,大量弗蘭克氏菌無法通過純培養獲得目標菌株[14-15]；加之其分離培養周期長、成功率低,大部分寄主植物的弗蘭克氏菌仍未分離得到純培養,分離到的菌株數量也極有限,使得弗蘭克氏菌的多樣性及其他應用研究進展緩慢[16]。

隨著高通量測序技術的發展,對弗蘭克氏菌多樣性的研究提供了更多便利。高通量測序等免培養分子生物學技術不僅能夠檢測到植物組織中相對豐度較低、難培養的內生微生物,且能為植物內生菌群落多樣性、相對豐度和稀有微生物信息提供更可靠且更全面的信息[17-18]。本課題組前期通過高通量測序發現,中國沙棘根瘤中除了弗蘭克氏菌外,還存在著內生非弗蘭克氏菌,且這些內生菌在同一寄主植物中還具有豐富的多樣性[19-20]。并且,高通量測序中,對沙棘屬植物弗蘭克氏菌的物種多樣性分子數據庫也缺乏足夠的不同來源寄主的數據,分析過程中沒有明確的劃分種水平操作分類單元(Operational taxonomic unit, OTU)的參考值。因此,本研究通過采用16S rRNA基因擴增子高通量測序技術,從門水平、屬水平和OTU水平剖析西藏沙棘根瘤內生弗蘭克氏菌和非弗蘭克氏菌的多樣性,以期為同一寄主植物中弗蘭克氏菌多樣性的研究提供思路。

1 研究方法

1.1 樣地信息及樣品采集

采樣地位于甘肅省天祝縣抓喜秀龍鄉金強河地區,經緯度為37°28′N,104°09′E,全區海拔在2900—4300 m之間,地處北祁連山東段。氣候寒冷潮濕,年均氣溫-2 ℃,年降水量560 mm,年蒸發量1592 mm,無絕對無霜期,僅分冷暖兩季,屬寒冷、干旱、半干旱高原性氣候[21]。于2018年9月21日在位于天祝縣金強河河灘地的西藏沙棘灌叢典型生境中,選取6株西藏沙棘植株,挖取其根瘤部分,并裝入無菌袋中進行保存。西藏沙棘的根瘤形態如圖1所示,西藏沙棘根瘤所處土壤環境的pH為7.33±0.12,含水量為(26.47±0.34)%。

圖1 西藏沙棘的根瘤形態Fig.1 Nodules morphology of Hippophae tibetana

1.2 西藏沙棘根瘤總DNA的提取、PCR擴增及高通量測序

根瘤內生菌總DNA的提取采用CTAB法并稍作修改[22-23],并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質量。使用帶Barcode的特異引物對總DNA的16S rRNA-V4區進行PCR擴增。PCR擴增采用50 μL PCR擴增體系,擴增反應條件為98 ℃預變性5 min,98 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,25個循環,最后72 ℃延伸5 min。PCR產物于2%瓊脂凝膠電泳檢測,剩余樣品4 ℃保存備用[24-25]。使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒進行文庫的構建,構建好的文庫經過Qubit 定量和文庫檢測合格后,使用Illumina Hiseq最長測序平臺進行上機測序。高通量測序過程由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.3 高通量測序數據處理與分析

使用Cutadapt(V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)[26]先對Reads進行低質量部分剪切,再根據Barcode從得到的Reads中拆分出各樣品數據,截去Barcode和引物序列初步質控得到原始數據經過以上處理后得到的Reads需要進行去除嵌合體序列的處理,Reads序列通過(https://github.com/torognes/vsearch/)[27]與物種注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列,并最終去除其中的嵌合體序列,得到最終的有效數據。利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001,http://www.drive5.com/uparse/)[28]對所有樣品的全部有效數據進行聚類,默認以97%的一致性將序列聚類成為不同的可操作分類單元,同時會選取OTUs中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs序列進行物種注釋,用Mothur方法與SILVA132(http://www.arb-silva.de/)[29]的SSUrRNA數據庫[30]進行物種注釋分析,獲得分類學信息并分別在各樣本的各個分類水平統計群落組成。

2 結果與分析

2.1 根瘤內生菌的群落組成

高通量測序共得到根瘤內生菌原始序列71858條,有效序列68265條,優質序列43219條,樣品測序覆蓋度為99.2%,測序深度達到分析要求且數據質量可靠。基于97%相似度的分類水平,共注釋到826個細菌OTU,分屬于22個門、33個綱、69個目、113個科和203個屬。相對豐度排名前10的門和屬如表1所示,結果表明,在門分類單元,西藏沙棘根瘤內生菌主要分布在放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)等,其中優勢門為放線菌門(Actinobacteria)。從屬水平來看,西藏沙棘根瘤內生菌主要分布在弗蘭克氏菌屬(Frankia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)等,優勢屬為弗蘭克氏菌屬(Frankia)。

表1 西藏沙棘根瘤內生菌相對豐度Table 1 Relative abundances of endophytes associated with H. tibetana root nodules

對豐度排名前10的屬進行物種分類樹繪制,結果如圖2所示。以上結果均表明,在沙棘根瘤內生菌中,不僅存在著大量的弗蘭克氏菌,還存在著非弗蘭克氏菌。

圖2 西藏沙棘根瘤內生菌物種分類樹狀圖Fig.2 Classification tree of endophytes associated with H. tibetana root nodulesMonera: 原核生物界; Actinobacteria: 放線菌門; Oxyphotobacteria: 生氧光細菌門; Proteobacteria: 變形菌門; Frankia: 弗蘭克氏菌屬; Kineococcus: 動球菌屬; Frondihabitans: 葉居菌屬; Friedmanniella: 弗萊德門氏菌屬; Unidentified Oxyphotobacteria: 未鑒定-生氧光細菌; Methylobacterium: 甲基桿菌屬; Sphingomonas: 鞘氨醇單胞菌屬; Pseudomonas: 假單胞菌屬; Stenotrophomonas: 寡養單胞菌屬; Massilia: 馬賽菌屬

2.2 土壤pH及含水量對西藏沙棘根瘤內生菌群落組成的影響

將西藏沙棘根瘤內生菌群落中優勢屬與土壤pH及含水量(Water content, WC)進行RDA分析,并使用Canoco 5進行結果可視化,結果如圖3所示。

圖3 西藏沙棘根瘤內生菌優勢屬相對豐度與土壤pH及含水量的RDA分析Fig.3 RDA analysis of relative abundances of dominant genera in H. tibetana root nodules with soil pH and water content RDA: 冗余分析 Redundancy Analysis; WC: 含水量 Water Content

RDA分析結果表明,排序軸RDA1和RDA2方差變量解釋分別為97.93%和2.07%；其中,弗蘭克氏菌屬和未鑒定-生氧光細菌的相對豐度與土壤pH及含水量的變化呈正相關,其余優勢屬的相對豐度則與土壤pH及含水量的變化呈負相關。

2.3 根瘤內生弗蘭克氏菌的多樣性

在西藏沙棘的根瘤內生菌中,弗蘭克氏菌為優勢屬。通過高通量測序技術檢測到西藏沙棘根瘤樣本中共含有7個弗蘭克氏菌屬的OTUs,選擇弗蘭克氏菌屬每個OTU的代表序列,與NCBI中已發表的39條弗蘭克氏菌屬16S rRNA基因序列進行比對,以與弗蘭克氏菌屬親緣關系最近的Acidothermuscellulolyticus作為外類群[31],構建系統發育樹,結果如圖4所示。

圖4 西藏沙棘根瘤內生弗蘭克氏菌系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Frankia species associated with H. tibetana root nodules 基于鄰接法, 節點上的數值為步長值(Bootstrap), 低于50%的數值(1000次重復)沒有顯示,括號內為含有NCBI中已發表弗蘭克氏菌16S rRNA基因的序列登錄號

圖4結果表明,高通量測序檢測到的弗蘭克氏菌OTU與來自歐洲、美洲、非洲、亞洲和大洋洲的鼠李科、胡頹子科、馬桑科、薔薇科、楊梅科、木麻黃科及樺木科等放線菌結瘤植物根瘤的弗蘭克氏菌被分為4個明顯的類群,包括未獲得純培養的根瘤弗蘭克氏菌(Clade I, unisolated strains),赤楊-楊梅-木麻黃侵染組的弗蘭克氏菌(Clade II, Alnus-Myrica-Casuarina infective strains),胡頹子科侵染組的弗蘭克氏菌(Clade III, Elaeagnaceae infective strains)及非典型菌株(Clade IV, Atypical strains)。OTU3和OTU241屬于胡頹子科侵染組的弗蘭克氏菌(Clade III),其中OTU3與Nouioui等[32]鑒定的Frankiaelaeagni相似度較高,而OTU241未能精確鑒定到種；OTU88、OTU1030、OTU1958、OTU1524和OTU2669屬于赤楊-楊梅-木麻黃侵染組的弗蘭克氏菌(Clade II),其中OTU88與Nouioui等[32]鑒定的Frankiaalni相似度較高,而OTU1030、OTU1958、OTU1524和OTU2669未能精確鑒定到種。

統計弗蘭克氏菌每個OTU代表序列的比對結果、OTU的序列數及其相對豐度,結果如表2所示。結果表明,各個弗蘭克氏菌的OTU在西藏沙棘根瘤中的豐度不同。

表2 西藏沙棘根瘤內生弗蘭克氏菌OTUs序列數及其代表序列分類鑒定Table 2 Sequences number of Frankia OTUs representative sequences associated with H. tibetana root nodules

以上結果均表明,在西藏沙棘根瘤中,存在著大量未被鑒定的弗蘭克氏菌,因此后續實驗可對西藏沙棘根瘤中的弗蘭克氏菌進行富集培養,并通過形態鑒定、生理生化和分子方法進行鑒定。

2.4 根瘤內生非弗蘭克氏菌的多樣性

在西藏沙棘的根瘤中,除了共生固氮的弗蘭克氏菌外,還存在著豐富的非弗蘭克氏菌。通過高通量測序發現,在非弗蘭克氏菌群中,優勢屬為假單胞菌屬(Pseudomonas),相對豐度為4.45%。除弗蘭克氏菌外,選擇相對豐度排名前9的西藏沙棘根瘤內生非弗蘭克氏菌的OTU的代表序列,構建系統發育樹,結果如圖5所示。結果表明,在相對豐度前9的西藏沙棘根瘤內生非弗蘭克氏菌中,鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)共含有10個不同的OTUs,表明其具有較高的多樣性；此外,甲基桿菌屬(Methylobacterium)含有4個不同的OTUs,馬賽菌屬(Massilia)含有3個不同的OTUs,假單胞菌屬(Pseudomonas)、未鑒定的生氧光細菌(unidentified Oxyphotobacteria)各含有2個不同的OTUs,寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、動球菌屬(Kineococcus)和弗蘭德門氏菌屬(Friedmanniella)在西藏沙棘的根瘤中僅被檢測到1個OTU。

圖5 西藏沙棘根瘤內生非弗蘭克氏菌系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of non-Frankia endophytes associated with H. tibetana root nodulesunidentified Oxyphotobacteria: 未鑒定-生氧光細菌; Kineococcus: 動球菌屬; Frondihabitans: 葉居菌屬; Friedmanniella: 弗萊德門氏菌屬; Pseudomonas: 假單胞菌屬; Stenotrophomonas: 寡養單胞菌屬; Massilia: 馬賽菌屬; Methylobacterium: 甲基桿菌屬; Sphingomonas: 鞘氨醇單胞菌屬

對每個OTU的代表序列在NCBI里進行BLAST比對,對其進行分類鑒定,并統計其在西藏沙棘根瘤中的序列數,結果如表3所示。結果表明,不同的非弗蘭克氏菌在西藏沙棘根瘤中的豐度不同；此外,屬于未鑒定的生氧光細菌中的OTU2和OTU13代表序列經NCBI中的BLAST比對后,無法精確鑒定到種。表3和圖5的結果均表明,西藏沙棘根瘤的內生非弗蘭克氏菌存在著豐富的物種多樣性。

表3 西藏沙棘根瘤內生非弗蘭克氏菌OTUs序列數及代表序列分類鑒定Table 3 Sequences number of non-Frankia OTUs and identification of their representative sequences associated with H. tibetana root nodules

3 討論

本研究采用16S rRNA基因擴增子高通量測序技術,對生長于天祝縣抓喜秀龍鄉金強河地區的西藏沙棘根瘤內生菌多樣性進行了研究。研究結果表明,西藏沙棘根瘤內生菌具有豐富的多樣性,不僅包含人們研究較多的能夠共生固氮的弗蘭克氏菌,還包含其他非弗蘭克氏菌。高通量測序方法檢測結果還表明,弗蘭克氏菌屬是西藏沙棘根瘤內生菌中的絕對優勢菌,其相對豐度高達47.63%。樊夢穎[33]采用高通量測序技術對沙棘屬植物中的中國沙棘根瘤內生細菌群落也進行過研究,發現中國沙棘根瘤細菌群落是極其豐富和多樣的,在根瘤中既有多種類型的放線菌也有多種類型的非放線菌,但均以弗蘭克氏菌屬細菌占絕對優勢。可見,不同沙棘屬植物根瘤內生菌中,弗蘭克氏菌屬均是優勢屬,其也是根瘤能夠固氮的主要貢獻者。

本研究在利用高通量測序對西藏沙棘根瘤內生菌多樣性進行分子鑒定時,對測序所得的序列進行相關序列分析,以OTU作為參考,在不同分類水平上對每一條序列進行劃分歸類[34],可將相似度大于97%的序列歸屬于相同物種,即分子種(phylotype)[35]。本研究通過高通量測序檢測到西藏沙棘根瘤中共含有7個屬于弗蘭克氏菌屬的OTUs,通過分析比對被歸屬于弗蘭克氏菌屬7個OTUs的16S rRNA序列,發現在西藏沙棘根瘤中,存在著和已發表序列相似度較高的序列,也存在著未能和已發表序列進行聚類的新種序列。因此,對于在西藏沙棘根瘤中檢測到的弗蘭克氏菌,后續還可結合純培養技術對分離獲得的菌株進行形態鑒定、生理生化鑒定和分子鑒定,以確定其是否為新種。張明明[36]采用相同方法,對中國沙棘根瘤弗蘭克氏菌屬的OTUs進行過分析,檢測到只有2個屬于弗蘭克氏菌屬的OTUs,可見,位于高寒地區的西藏沙棘根瘤內相對于其他沙棘屬植物根瘤可能含有更為豐富的弗蘭克氏菌資源。

對于沙棘屬植物根瘤內弗蘭克氏菌多樣性的研究,已有學者采用不同的方法進行過相關研究,陳立紅等[10]利用PCR-RFLP分子標記方法,對不同樣地分布的中國沙棘根瘤內的弗蘭克氏菌的遺傳多樣性研究發現,中國沙棘根瘤中的弗蘭克氏菌在多數地點至少有2種不同基因型,且中國沙棘根瘤共生弗蘭克氏菌具有豐富的遺傳多樣性,在不同采樣點沙棘根瘤內弗蘭克氏菌遺傳多樣性的豐富度不一樣。徐瑞瑞[8]采用了從根瘤內直接擴增DNA的技術,通過16S rRNA全長序列分析,研究了內蒙磴口和黑龍江孫吳沙棘根瘤弗蘭克氏菌的系統發育關系,發現在根瘤共生體中,除了共生的弗蘭克氏菌外,還廣泛存在著非弗蘭克氏放線菌,且鑒定沙棘根瘤中直接擴增的弗蘭克氏菌,隸屬于胡頹子侵染組。本研究通過構建系統發育樹也發現,西藏沙棘根瘤中的部分弗蘭克氏菌不僅可以侵染胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(Hippophae)的西藏沙棘,還能夠侵染樺木科(Betulaceae)榿木屬(Alnus)的赤楊(Alnusjaponica)及木麻黃科(Casuarinaceae)木麻黃屬(Casuarina)的木麻黃(Casuarinaequisetifolia)等非豆科植物,表明西藏沙棘根瘤中的某些弗蘭克氏菌株具有寄主植物的多樣性。

本研究還發現,西藏沙棘根瘤中的非弗蘭克氏內生菌主要有假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等。其中,假單胞菌屬為本研究中檢測到的相對豐度僅次于弗蘭克氏菌屬的優勢屬,其相對豐度為4.45%,包含2個OTUs。假單胞菌屬細菌能夠廣泛分布于各種類型的生境中,包括在植物的根瘤內[37]。徐瑞瑞[8]采用根瘤勻漿法和根瘤切片法,對沙棘根瘤內生菌進行了純培養,得到18株非弗蘭克氏放線菌,分別屬于諾卡氏菌屬和小單孢菌屬。可見,采用的研究方法不同,沙棘屬植物根瘤內的非弗蘭克氏放線菌的優勢屬也存在一定的差異；這主要與純培養時采用的培養基與方法和內生菌生存的自然生態環境之間的差異有關。有研究表明,假單胞菌是宿主植物根內主要的促生菌群[17,38]。但目前關于弗蘭克氏菌和假單胞菌等非根瘤菌之間的相互作用,以及假單胞菌與西藏沙棘的互作關系仍有待于深入的探究。而在根瘤中的鞘氨醇單胞菌屬,具有10個OTUs,表明其在西藏沙棘根瘤內具有最為豐富的物種多樣性。因此,為了探明西藏沙棘根瘤內生菌的多樣性,仍需要開展進一步的研究,將高通量測序等免培養分子生物學技術與純培養方法相結合,并對內生菌之間的相互作用進行探究及驗證,不僅能夠豐富西藏沙棘根瘤內生菌菌種資源,還能夠為西藏沙棘適應高寒特殊生境的機制提供理論依據。