甘草次酸抗腫瘤衍生物的設計、合成及其活性評價

高 豐,周 菲,陳紅珊,亓金釵,李 桐,張梓杰,楊笑云,蔡德生,戴子琦,徐 冰,雷海民

(北京中醫藥大學,北京 102488)

惡性腫瘤嚴重威脅人類的生命并降低生活質量，世界衛生組織統計數據表明，2020年全球新發癌癥病例1 929萬例，死亡病例996萬例，是目前世界上主要的公共衛生問題之一[1]。目前對于惡性腫瘤的主要治療方法包括手術治療、放化療等，而細胞毒類藥物仍是臨床一線化療藥物的主體，但由于其毒性和不良反應大、耐藥性強，已經難以滿足臨床治療的需求[2-3]。近年來，對從天然產物中提取分離得到的有效成分進行結構修飾已成為國內外抗腫瘤藥物研究的熱點[4-8]。三萜類化合物是指具有6個異戊二烯基本結構單元的化合物，廣泛分布于自然界中，其具有廣泛的藥理活性[9-10]。甘草次酸(GA)作為中藥甘草中主要成分甘草酸的苷元[11]，是最常見的五環三萜類化合物，廉價易得[12-13]，但其母核抗腫瘤活性不強，高劑量長時間使用會導致如假性醛固酮增多癥等不良反應，因此需要進行結構修飾來改善其活性[14-16]。

本課題組前期研究發現，在三萜類化合物中引入氨基酸片段可顯著提高其抗腫瘤活性及水溶性[17-18]，同時發現，GA母核C-30處酯化可以提高其抗腫瘤活性，特別是在C-30處引入芐基酯抗腫瘤活性最好[19-21]。研究表明，化合物的鍵合方式可能會影響其抗腫瘤活性，酰胺鍵既能提高衍生物的活性，又能提高其代謝穩定性[22-24]。

本研究以GA為母核，基于拼合原理，設計、合成出6個結構新穎的GA衍生物，通過四甲基偶氮唑藍(MTT)法評價了其體外抗腫瘤活性，篩選出優勢化合物；同時初步討論了其構效關系；進一步通過4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法觀察了其對HepG2細胞形態的影響，研究思路和研究結果可為GA的后續結構修飾改造提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 磁力攪拌器(德國IKA公司)；SARRORIUS-BS124S型電子分析天平(德國賽多利斯股份有限公司);N-1300D-W型旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社);X-5型顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司)；Bruker Avance 400型核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；SGW-2自動旋光儀(美國魯道夫公司)；Agilent Q-TOF質譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Thermo 3111型CO2培養箱和Multiskan GO 酶標儀，均購自美國賽默飛世爾科技公司;Olympus倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯株式會社)。

1.2試藥 甘草次酸(GA，批號FY20Y011201，質量分數為98%，南通飛宇生物科技有限公司)；1-boc-N-fmoc-L-組氨酸(批號GLS180111-36704，上海吉爾生化有限公司)；氰基硼氫鈉(批號C11502500，上海麥克林生化科技有限公司)；溴化芐(批號KYEKR17)、醋酸銨(批號20110107)、三氧化鉻(批號A14105)和1-羥基苯并三唑(HOBt，批號KSCIT12)，均購自北京伊諾凱科技有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI，批號C1926072)和哌啶(批號104094-4X100ML)，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-二甲氨基吡啶(DMAP，批號1224275，上海晶純生化科技股份有限公司)；N,N-二異丙基乙胺(DIPEA，批號P1234338，上海阿達馬斯試劑有限公司)；二氯甲烷、無水硫酸鈉、碳酸氫鈉、三氟乙酸、濃硫酸、碳酸鉀、二甲基亞砜(DMSO)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等均為分析純，均購自北京化工廠；四甲基偶氮唑藍(MTT，批號20200606，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；RPMI-1640培養基(批號AF29584257)、DMEM培養基(批號8120350)、2.5 g·L-1胰蛋白酶溶液(批號2122153)、磷酸鹽緩沖鹽(PBS,批號2177715)、胎牛血清(批號20030502)和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI染料，批號6709771)，均購自北京拜爾迪生物科技有限公司；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)。

1.3細胞株 人肝癌細胞HepG2、人肺癌細胞A549、人結腸癌細胞HCT-116、人正常肝細胞L02和大鼠心肌細胞H9C2，均購自北京協和醫院細胞資源中心。

2 方法

2.1化學合成

2.1.1中間體30芐基酯甘草次酸(GA-BN) 稱取GA (2 g，4.25 mmol)、溴化芐 (872.30 mg，5.1 mmol)，置于50 mL茄形反應瓶中，加入DMF 20 mL，隨后加入碳酸鉀 (1 762.18 mg，12.75 mmol)，80 ℃加熱回流3 h，薄層色譜(TLC)監測GA反應完全，停止反應；DMF減壓濃縮后加二氯甲烷溶解，將溶液轉移至分液漏斗，依次用水和飽和食鹽水 (15 mL)洗滌，無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮后將產物置于硅膠柱上分離，得白色固體，即GA-BN。

2.1.2化合物1稱取2.1.1項下制備的GA-BN (800 mg,1.43 mmol)和1-boc-N-fmoc-L-組氨酸 (819.41 mg,1.72 mmol)，置于50 mL茄形反應瓶中，加入EDCI (412.16 mg,2.15 mmol)和DMAP (17.10 mg，0.14 mmol)，室溫攪拌6 h，TLC監測GA-BN反應完全，停止反應；將反應液轉移至分液漏斗，依次用水和飽和食鹽水 (15 mL) 洗滌，無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮后將產物置于硅膠柱上分離，得白色固體，即化合物1。

2.1.3化合物2稱取化合物1(800 mg,0.78 mmol)，置于50 mL茄形反應瓶中，隨后加入無水二氯甲烷 (15 mL)溶解，并在冰浴條件下緩慢加入三氟乙酸 (4 mL)，TLC監測化合物1反應完全，停止反應；將反應液轉移至分液漏斗，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取2次，無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮后將產物置于硅膠柱上分離，得白色固體，即化合物2。

2.1.4化合物3稱取化合物2(400 mg，0.44 mmol)，置于50 mL茄形反應瓶中，加入DMF 20 mL和哌啶2 mL，室溫攪拌，TLC監測化合物2反應完全，停止反應；將反應液轉移至分液漏斗，依次用水和飽和食鹽水 (15 mL)洗滌，無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮后將產物置于硅膠柱上分離，得白色固體，即化合物3。見圖1。

圖1 化合物1～3的合成路線

2.1.5中間體30-芐基酯-3-羧基甘草次酸 (GO-BN) 稱取GA-BN (1 g,1.79 mmol)及三氧化鉻、濃硫酸，置于50 mL茄形反應瓶中，加入H2O 10 mL，冰浴下攪拌30 min，TLC監測GA-BN反應完全，停止反應；將反應液轉移至分液漏斗，依次用水和飽和食鹽水 (15 mL)洗滌，無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮后將產物置于硅膠柱上分離，得白色固體，即中間體GO-BN。

2.1.6中間體30-芐基酯-3-氨基甘草次酸(GN-BN) 稱取2.1.5項下制備的GO-BN (800 mg，1.43 mmol)和氰基硼氫鈉 (108.11 mg，1.72 mmol)及醋酸銨 (1 102.24 mg，14.30 mmol)，置于50 mL茄形反應瓶中，加無水甲醇 (20 mL)，室溫下攪拌12 h，TLC監測GO-BN反應完全，停止反應；將反應液轉移至分液漏斗，依次用水和飽和食鹽水 (15 mL)洗滌，無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮后將產物置于硅膠柱上分離，得白色固體，即中間體GN-BN。

2.1.7化合物4稱取2.1.6項下制備的GN-BN (600 mg,1.07 mmol)和1-boc-N-fmoc-L-組氨酸 (612.47 mg,1.29 mmol)，置于50 mL茄形反應瓶中，加入EDCI (306.56 mg，1.61 mmol)和HOBt (216.87 mg，1.61 mmol)及DIPEA (345.08 mg，2.68 mmol)，室溫攪拌12 h，TLC監測GN-BN反應完全，停止反應；將反應液轉移至分液漏斗，依次用水和飽和食鹽水 (15 mL)洗滌，無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮后將產物置于硅膠柱上分離，得白色固體，即化合物4。

2.1.8化合物5稱取化合物4(300 mg,0.29 mmol)，置于50 mL茄形反應瓶中，隨后加入無水二氯甲烷15 mL溶解，并在冰浴條件下緩慢加入三氟乙酸4 mL，TLC監測化合物4反應完全，停止反應；將反應液轉移至分液漏斗，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取2次，無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮后將產物置于硅膠柱上分離，得白色固體，即化合物5。

2.1.9化合物6稱取化合物5(200 mg,0.25 mmol)，置于50 mL茄形反應瓶中，加入DMF 20 mL和哌啶2 mL，常溫攪拌，TLC監測化合物5反應完全，停止反應；將反應液轉移至分液漏斗，依次用水和飽和食鹽水 (15 mL)洗滌，無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮后將產物置于硅膠柱上分離，得白色固體，即化合物6。見圖2。

圖2 化合物4～6的合成路線

2.2體外抗腫瘤活性篩選 取處于對數生長期的細胞接種于96孔板中，每孔3×103個，將96孔板置于37 ℃、體積分數為5% CO2的細胞培養箱中培養。24 h后，給藥組每孔加入100 μL含不同質量濃度化合物的培養液，空白組加入100 μL空白培養基，每組設置3個復孔，于培養箱中繼續培養72 h后每孔加入20 μL質量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，于培養箱中繼續培養4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，輕度振蕩溶解后，用酶標儀在490 nm波長處測定吸光度值A。用公式抑制率=[1-(A給藥組-A空白組)÷(A對照組-A空白組)]×100%計算細胞生長抑制率。采用Graphpad Prism 5.0軟件計算半數抑制濃度IC50值，實驗平行重復3次。

2.3DAPI染色觀察細胞核形態變化 取處于對數生長期的人肝癌細胞HepG2接種于24孔板中，每孔1.5×104個細胞，置于37 ℃、體積分數為5%CO2的細胞培養箱中培養24 h后，加入化合物6，終濃度分別為1、3、5 μmol·L-1，每組平行3個復孔，于培養箱中繼續培養72 h，棄去培養基，用PBS緩沖液漂洗2遍，加入體積分數為4%的多聚甲醛固定10 min，隨后棄去多聚甲醛，用PBS緩沖液漂洗2遍，加入DAPI染液，作用3 min，棄去剩余染液，PBS緩沖液漂洗2遍，于倒置熒光顯微鏡100倍下觀察細胞核形態并拍照。

3 結果

3.1結構鑒定

化合物13β-[1-boc-N-fmoc-L-組氨酸]-11-氧代-齊墩果烷-12-烯-30-芐基酯 (benzyl 3β-[1-boc-N-fmoc-L-histidine]-11-oxo-olean-12-en-30-oate):白色固體，收率為57.1%；熔點為122.8 ℃，[α]D=+ 124 (c=0.3 mg·mL-1,MeOH)；1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ(ppm) 8.04 (s，1H,-NCHN-)，7.77(d,2H,H-Ar of fmoc,J=8 Hz),7.61(m,2H,H-Ar of fmoc)，7.41～7.26 (m，9H，H-Ar and 2×-CH2-of fmoc),7.18(s,1H，-CCHN-),5.53(s,1H,H-12),5.18,5.10(d,each,1H，Bn-CH2,J=12.0 Hz),4.66(m,1H,-NHCHCO-),4.52(m,1H,H-3),4.34(m,2H,-CHCH2O-)，4.24 (m，1H，-CH-of fmoc),3.18～2.99 (m，2H，-CH2-of histidine)，2.33(s,1H,H-9),2.04(m,1H,H-18),2.01～1.64,1.57～1.35，1.31～1.19,1.06～1.01(m,18H,methylene and methine of triterpenoid structure),1.61(brs,9H,3×-CH3of boc)，1.33 (s,3H,H-29),1.16(s,3H,H-27),1.12(s,1H,H-25),1.09(s，3H,H-28),0.97(m,1H,H-5),0.84(s,3H,H-24),0.81(s,3H，H-23),0.73(s,3H,H-26)。13C NMR (400 MHz,CDCl3)δ(ppm)200.1 (C-11),176.3(C-30),171.4(his-COO),169.2(C-13),156.2 (boc-COO),146.9(fmoc-COO),144.1(-C=CCH-of fmoc),141.4 (-C=CCH- of fmoc),138.7(-CH=C-N-),136.9(-N=CH-N-),136.3 (Bn-Car),128.7 (Bn-Car),128.6,128.5(Bn-Car),128.4 (Bn-Car)，127.8(fmoc-Car),127.2(fmoc-Car),125.4(fmoc-Car),120.1 (fmoc-Car),114.9 (-C=CNH-),85.9,82.2 (boc-q.C),67.3 (-CH2- of fmoc),66.3(Bn-CH2),61.7,55.7,54.2 (his-CHNH),48.4,47.3 (-CH- of fmoc),45.5,44.1,43.3,41.2,38.8,38.2,37.8,37.0,32.8，31.9，31.0,30.1,28.5，28.4，28.1，28.0，26.6，26.5，23.5，23.4，18.8，17.4,16.8,16.5。HRMS (ESI)m/z:1 020.570 6 [M+H]+,calcd.for C63H78N3O91 020.573 8。

化合物23β-[N-fmoc-L-組氨酸]-11-氧代-齊墩果烷-12-烯-30-芐基酯 (benzyl 3β-[N-fmoc-L-histidine]-11-oxo-olean-12-en-30-oate):白色固體,收率為55.3%;熔點為119.0 ℃，[α]D=+92 (c=0.3 mg·mL-1，MeOH)；1H NMR (400 MHz，CDCl3):δ(ppm) 7.69 (m，2H，H-Ar of fmoc)，7.50 (m，2H，H-Ar of fmoc and -CCHN-)，7.39～7.29，7.24～7.17 (m，9H，H-Ar and 2×-CH2- of fmoc)，5.57 (s，1H，H-12)，5.20，5.10 (d，each，1H，Bn-CH2，J=12.0 Hz)，4.57 (m，2H，-NHCHCO- and H-3)，4.30 (m，2H，-CHCH2O-)，4.12 (m，1H，-CH- of fmoc)，3.42-2.90 (m，2H，-CH2- of histidine)，2.33 (s，1H，H-9)，2.06 (m，1H，H-18)，2.03～1.35，1.29～1.20，1.04～1.00 (m，18H，methylene and methine of triterpenoid structure)，1.31 (s，3H，H-29)，1.15 (s，6H，H-27 and H-25)，1.08 (s，3H，H-28)，0.97 (m，1H，H-5)，0.80 (s，6H，H-23 and H-24)，0.72 (s，3H，H-26)。13C NMR (400 MHz，CDCl3)δ(ppm) 200.8 (C-11)，176.4 (C-30)，170.5 (his-COO)，170.3 (C-13)，143.7 (fmoc-COO)，143.6 (-C=CCH- of fmoc)，141.4 (-C=CCH- of fmoc)，139.1 (-CH=CNH-)，136.2 (Bn-Car)，133.6 (-N=CH-NH-)，128.7 (Bn-Car)，128.6 (C-12)，128.5 (Bn-Car)，128.4 (Bn-Car)，127.9 (fmoc-Car)，127.2 (fmoc-Car)，125.1 (fmoc-Car)，120.1 (fmoc-Car)，117.1 (-CH=CNH-)，83.4 (C-3)，67.6 (-CH2- of fmoc)，66.4(Bn-CH2)，61.7，55.0，53.6 (his-CHNH)，48.4，47.0 (-CH- of fmoc)，45.6，44.1，43.4，41.2，38.7,38.2，37.8，37.0，32.7，31.9，31.3，28.6，28.4，28.2，28.1，26.5，26.5，23.5，23.4，18.8，17.4，16.7，16.5。HRMS (ESI)m/z:920.519 0 [M+H]+，calcd.for C58H70N3O7920.521 4。

化合物33β-[L-組氨酸]-11-氧代-齊墩果烷-12-烯-30-芐基酯 (benzyl 3β-[L-histidine]-11-oxo-olean-12-en-30-oate):白色固體,收率為59.2%;熔點為156.2 ℃，[α]D=+ 116.67 (c=0.3 mg·mL-1，MeOH)；1H NMR (400 MHz，CDCl3):δ(ppm) 7.54 (s，1H，-CCHN-)，7.36 (m，5H，H-Ar)，5.54 (s，1H，H-12)，5.18，5.10 (d，each，1H，Bn-CH2，J=12.0 Hz)，4.54 (m，1H，H-3)，3.80 (m，2H，-NHCHCO-)，2.82 (m，2H，-CH2- of histidine)，2.33 (s，1H，H-9)，2.04 (m，1H，H-18)，2.01～1.34 (m，18H，methylene and methine of triterpenoid structure)，1.15 (s，6H，H-29 and H-27)，1.10 (s，3H，H-25)，0.98 (m，1H，H-5)，0.88 (s，3H，H-24)，0.80 (s，3H，H-23)，0.73 (s，3H，H-26)。13C NMR (400 MHz，CDCl3)δ(ppm) 200.1 (C-11)，176.3 (C-30)，170.5 (his-COO)，169.4 (C-13)，136.3 (-CH=CNH-)，136.2 (Bn-Car)，135.1 (-N=CH-NH-)，128.7 (Bn-Car)，128.6 (C-12)，128.4 (Bn-Car)，119.7 (-CH=CNH-)，82.0，66.4 (Bn-CH2)，61.8，55.1，54.7 (His-CHNH)，48.4，45.5，44.1，43.3，41.2，38.9，38.3，37.8，37.0，32.8，31.9 31.3，29.8，28.6，28.4，28.2，26.6，26.5，23.8，23.4，18.8，17.5，17.0，16.5。HRMS (ESI)m/z:698.452 5 [M+H]+，calcd.for C43H59N3O5697.445 5。

化合物43β-[(1-boc-N-fmoc-L-組氨酸)酰基]-11-氧代-齊墩果烷-12-烯-30-芐基酯 (benzyl 3β-[(1-boc-N-fmoc-L-histidine)amino]-11-oxo-olean-12-en-30-oate):白色固體,收率為51.4%;熔點為139.5 ℃，[α]D=+124 (c=0.3 mg·mL-1，MeOH)；1H NMR (400 MHz，CDCl3):δ(ppm) 8.05 (s，1H，-NCHN-)，7.77 (d，2H，H-Ar of fmoc，J=8.0 Hz)，7.60 (m，2H，H-Ar of fmoc)，7.44～7.28 (m，9H，H-Ar and 2×-CH2- of fmoc)，7.20 (s，1H，-CCHN-)，5.53 (s，1H，H-12)，5.21，5.10 (d，each，1H，Bn-CH2，J=12.0 Hz)，4.48 (m，1H，-NHCHCO-)，4.37 (m，2H，-CHCH2O-)，4.23 (m，1H，-CH- of fmoc)，3.60 (m，1H，H-3)，3.12 (m，1H，-CH2- of histidine)，2.98 (m，1H，-CH2- of histidine)，2.33 (s，1H，H-9)，2.04 (m，1H，H-18)，2.01～1.65，1.58～1.38，1.32～1.20，0.93～0.76 (m，18H，methylene and methine of triterpenoid structure)，1.60 (brs，9H，3×-CH3of boc)，1.34 (s，3H，H-29)，1.16 (s，6H，H-27 and H-25)，1.09 (s，3H，H-28)，1.08 (s，3H，H-24)，0.97 (m，1H，H-5)，0.72 (s，3H，H-23)，0.65 (s，3H，H-26)。13C NMR (400 MHz，CDCl3)δ(ppm) 200.2 (C-11)，176.4 (C-30)，170.5 (his-CONH)，169.2 (C-13)，156.3 (boc-COO)，146.9 (fmoc-COO)，144.0 (-C=CCH- of fmoc)，141.4 (-C=CCH- of fmoc),139.3 (-CH=C-N-)，136.9 (-N=CH-N-)，136.3 (Bn-Car)，128.7 (Bn-Car)，128.6 (C-12)，128.5 (Bn-Car)，128.4 (Bn-Car)，127.9 (fmoc-Car)，127.2 (fmoc-Car),125.3 (fmoc-Car),120.1 (fmoc-Car)，115.0 (-C=CNH-)，86.0 (boc-q.C)，67.3 (-CH2-of fmoc)，66.3 (Bn-CH2)，61.8，56.7，55.6，55.2 (his-CHNH)，48.4，47.2 (-CH-of fmoc)，45.4，44.1，43.3，41.2，39.8，38.2，37.8，37.0，32.8，31.9，31.3，30.5，28.6，28.4，28.4，28.0，26.5，25.3，23.4，23.4，18.8，17.8，16.5，16.4。HRMS (ESI)m/z:1 019.587 2 [M+H]+，calcd.for C63H79N4O81 019.589 8。

化合物53β-[(N-fmoc-L-組氨酸)酰基]-11-氧代-齊墩果烷-12-烯-30-芐基酯 (benzyl 3β-[(N-fmoc-L-histidine)amino]-11-oxo-olean-12-en-30-oate):白色固體,收率為80.2%;熔點為122.5 ℃,[α]D=+120 (c=0.3 mg·mL-1，MeOH)；1H NMR (400 MHz，CDCl3):δ(ppm) 7.77 (d，2H，H-Ar of fmoc，J=8.0 Hz)，7.59 (m，2H，H-Ar of fmoc and -CCHN-)，7.44～7.27 (m，9H，H-Ar and 2×-CH2- of fmoc)，5.53 (s，1H，H-12)，5.21，5.10 (d，each，1H，Bn-CH2，J=12.4 Hz)，4.51 (m，1H，-NHCHCO-)，4.36 (m，2H，-CHCH2O-)，4.21 (m，1H，-CH-of fmoc)，3.58 (m，1H，H-3)，3.15 (m，1H，-CH2- of histidine)，3.03 (m，1H，-CH2- of histidine)，2.33 (s，1H，H-9)，2.04 (m，1H，H-18)，2.01～1.38，1.32～1.27，0.94～0.76 (m，18H，methylene and methine of triterpenoid structure)，1.34 (s，3H，H-29)，1.16 (s，6H，H-27 and H-25)，1.08 (s，6H，H-28 and H-24)，0.97 (m，1H，H-5)，0.72 (s，3H，H-23)，0.66 (s，3H，H-26)。13C NMR (400 MHz，CDCl3)δ(ppm) 200.4 (C-11)，176.4 (C-30),171.0 (his-CONH)，169.5 (C-13)，143.9 (fmoc-COO)，143.9 (-C=CCH- of fmoc)，141.4 (-C=CCH- of fmoc)，139.1 (-CH=CNH-)，136.3 (Bn-Car)，135.0 (-CH=CNH-)，128.7 (Bn-Car)，128.6 (C-12)，128.5 (Bn-Car)，128.4 (Bn-Car)，127.9 (fmoc-Car)，127.2 (fmoc-Car)，125.3 (fmoc-Car)，120.2 (fmoc-Car)，117.5 (-CH=CNH-)，67.4 (-CH2- of fmoc)，66.4 (Bn-CH2)，61.8，56.8，55.6，55.3 (his-CHNH)，48.4，47.2，45.5，44.1，43.3，41.2，39.8，38.2，37.8，37.0，32.8，31.9，31.3，28.6，28.5，28.4，28.，26.5，26.5，25.2，23.4，18.8，17.8，16.6，16.3。HRMS (ESI)m/z:919.535 9 [M+H]+，calcd.for C58H71N4O6919.537 4。

化合物63β-[(L-組氨酸)酰基]-11-氧代-齊墩果烷-12-烯-30-芐基酯 (benzyl 3β-[(L-histidine)amino]-11-oxo-olean-12-en-30-oate):白色固體,收率為60.7%;熔點為276.6 ℃,[α]D=+166.67 (c=0.3 mg·mL-1，MeOH)；1H NMR (400 MHz，CDCl3):δ(ppm) 7.58 (s,1H，-NCHN-)，7.48 (s，1H，-CCHN-)，7.36 (m，5H，H-Ar)，5.54 (s，1H，H-12)，5.18，5.10 (d，each，1H，Bn-CH2，J=12.0 Hz)，3.67 (m，1H，-NHCHCO-),3.59 (m，1H，H-3),3.02 (m，2H，-CH2- of histidine)，2.35(s,1H，H-9),2.04 (m，1H，H-18)，1.92～1.25 (m,18H，methylene and methine of triterpenoid structure)，1.16 (s，6H,H-27)，1.11 (s，3H，H-29),1.09 (s，3H，H-25)，0.97 (m，1H，H-5)，0.82 (s，3H，H-24),0.77 (s，3H，H-23)，0.72 (s，3H，H-26)。13C NMR (400 MHz，CDCl3)δ(ppm) 200.3 (C-11)，176.5 (C-30)，174.0 (his-CONH)，169.4 (C-13)，136.2 (-CH=CNH-),136.2 (Bn-Car)，135.3 (-N=CH-NH-)，128.7 (Bn-Car)，128.6 (C-12)，128.4 (Bn-Car)，66.4 (Bn-CH2)，61.8,56.6，55.6，55.0 (his-CHNH)，48.4，45.5，44.1，43.3，41.2，38.9，38.3，37.8，37.1，32.8，31.9，31.3，29.8 (NHCHCH2)，28.7，28.6，28.4，26.6，26.5，25.4，23.4，18.8，17.9，16.8，16.4。HRMS (ESI)m/z:697.469 9 [M+H]+，calcd.for C43H60N4O4696.461 5。

3.2體外抗腫瘤活性測定 通過MTT實驗評價了合成的6種結構新穎的GA衍生物對3種腫瘤細胞的抗腫瘤活性及2種正常細胞的毒性，結果見表1。研究發現，C-3位以酰胺鍵連接的化合物活性均明顯強于以酯鍵連接的化合物；脫掉Boc保護基后裸露出仲胺基對細胞毒性并無明顯提升，而進一步將fmoc保護基脫掉后露出伯胺基后抗腫瘤活性得到明顯提升，可推斷出伯胺的暴露對GA衍生物的細胞毒活性起著重要的作用。其中化合物6對HepG2的抗腫瘤活性(IC50=2.98±0.69 μmol·L-1)優于陽性對照藥索拉菲尼(IC50=7.07±0.30 μmol·L-1)，且其對L02細胞的毒性(IC50=4.93±0.03 μmol·L-1)低于索拉菲尼(IC50=1.97±0.65 μmol·L-1)。

表1 甘草次酸衍生物對不同細胞的IC50

3.3DAPI染色觀察細胞核形態變化 DAPI染料能與DNA特異性結合，在一定波長下發出熒光，所以該染料常用于細胞核形態學觀察。DAPI染色結果見圖3。由圖3可知，空白對照組細胞數量較多，細胞核呈藍色，形態完整；化合物6給藥濃度為1 μmol·L-1時，細胞變化不明顯，僅見少量細胞出現核形態變化；當給藥濃度為3、5 μmol·L-1時，細胞數量明顯減少，細胞核可見碎裂和固縮的現象，而細胞核破碎和固縮是腫瘤細胞凋亡的典型特征。由此可見，化合物6通過誘導人肝癌細胞HepG2凋亡發揮抗腫瘤作用。

圖3 化合物6對HepG2細胞DAPI染色圖

4 討論

GA作為抗癌先導化合物受到世界各國科學家的廣泛關注，但其抗腫瘤活性并不明顯。為了提高GA的細胞毒性，探討鍵合方式及氨基酸中伯胺及仲胺基團對抗腫瘤活性的影響，本研究以GA為母核，在C-30位引入親脂性基團芐基，同時在C-3位分別以酯鍵與酰胺鍵的成鍵方式引入小分子氨基酸，設計并合成出6個結構新穎的GA衍生物，利用MTT法篩選得到優勢化合物6，其對人肝癌細胞HepG2的抑制作用強于陽性對照藥索拉菲尼，同時對人正常肝細胞L02的毒性低于索拉菲尼，表現出一定的細胞毒選擇性。DAPI染色進一步研究表明，其可通過誘導腫瘤細胞細胞核固縮、碎裂而使腫瘤細胞凋亡。本研究可為其他GA抗腫瘤衍生物的發現奠定基礎。