高效液相色譜法測定口腔清潔護理用品中o-傘花烴-5-醇含量的研究

施裔磊 俞曉燕

(上海美加凈日化有限公司，上海 200333)

1 研究背景

1.1 o-傘花烴-5-醇簡介

o-傘花烴-5-醇(IPMP)，又名3-甲基-4-異丙基苯酚，分子式為C10H14O，摩爾質量為150.22g/mol，常溫下為無色或白色針狀晶體，易溶于甲醇、乙醇和異丙醇，可溶于乙二醇和丙二醇，不溶于水。IPMP目前作為一種抑菌劑被廣泛應用于牙膏、漱口水、化妝品、藥品等領域。

o-傘花烴-5-醇為源自于唇形科植物的天然提取物，為香精油的主要成分。由于生物膜表面的油質作用，傳統的殺菌藥物難以滲透至生物膜深處，故只能殺死表層細菌，無法對牙菌斑深處的細菌進行深層殺滅[1]。IPMP因與其疏水性、電解特性和摩爾質量有關的特性，可以穿透至菌斑深層進行抗菌作用，能夠迅速浸入到菌膜內， 具有良好的滲透作用，用于牙膏中有抗牙菌斑、清新口氣、保持牙齦健康的作用。經研究分析，IPMP能夠直接作用于口腔細菌的生化反應酶或其他活性物質，從而影響細胞內酶的活性，降低酶活性或者直接使酶失活，最終導致細胞停止生長、細菌死亡[2]。

Karkar等[3]對含0.1% o-傘花烴-5-醇/0.6%氯化鋅牙膏的護齦效果進行了研究。由224位受試者參與的臨床實驗數據顯示，每天早晚兩次使用該牙膏，連續刷牙6周和12周后，與使用傳統含氟牙膏(含氟化鈉0.204%)的受試者相比，使用含0.1%o-傘花烴-5-醇/0.6%氯化鋅刷牙的受試者在6周和12周時，牙齦指數(GI)、出血指數(BI)及菌斑指數(PI)較前者均降低了12.3%、18.5%和13.2%及38.1%、37.8%和24.2%，并具有顯著性差異。

陳雯杰等[1]采用懸液定量殺菌實驗方法，對IPMP殺滅金黃色葡萄球菌的效果進行評價。結果以含5000 mg/L IPMP與50%二甲亞砜水溶液對懸液內金黃色葡萄球菌作用 5min，或5 000 mg/L IPMP溶液對懸液內金黃色葡萄球菌 15min，殺滅對數值均>5.00。結果表明 o-傘花烴-5-醇/二甲亞砜水溶液可有效殺滅金黃色葡萄球菌。陳敏珊等[4]研究將o-傘花烴-5-醇與葡萄柚提取物復配組合，并應用到牙膏等產品中。二者的聯合使用對抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌均具有相加作用，特別是對抑制變異鏈球菌的相加作用明顯。

1.2 o-傘花烴-5-醇的安全性

o-傘花烴-5-醇是一種安全性較高的化合物。經美國化妝品審查專家小組(CIR)評估[5,6]，小鼠急性經口毒性LD50為2.2g/(kg·bw)，屬于低毒物質；采用含1%IPMP的凡士林對家兔進行眼刺激實驗，4h內家兔結膜有輕微充血，24h內與對照組的結果相似，屬微刺激性；采用含10%IPMP乙醇溶液對豚鼠進行皮膚刺激性實驗，在皮膚表皮每天涂抹0.3mL劑量的受試物，連續3天，觀察涂抹部位皮膚反應，皮膚刺激反應標準為0～4分，結果含10% IPMP乙醇溶液的得分為0.22，刺激性極低。對53名女性受試者皮膚刺激性臨床實驗數據顯示，皮膚經涂抹含0.1%及1.0%的凡士林，24h后涂抹部位皮膚未出現刺激反應；對27名男性受試者皮膚致敏性臨床實驗數據同樣顯示，o-傘花烴-5-醇對皮膚的致敏強度極弱。同時，還有許多研究對 IPMP 的急性腸外毒性、短期口服毒性、短期腸外毒性、亞慢性口服毒性、和致突變毒性等方面進行評估，CIR專家小組得出化妝品中o-傘花烴-5-醇含量在0.5%的上限范圍內使用是安全的。

目前，國內外相關法規如《化妝品安全技術規范(2015版)》、《牙膏用原料規范(GB22115)》、《歐盟化妝品法規 (EC)No 1223/2009》等均對o-傘花烴-5-醇在化妝品、牙膏等產品中作為防腐劑使用時的用量進行了規定，其在產品中的最大允許使用濃度均為0.1%。在日本，o-傘花烴-5-醇被作為一種抑菌成分廣泛用于藥品和日化產品中。其中，在牙膏等口腔健康產品中的最大允許濃度為0.05%。IPMP被FDA批準作為一種直接或間接的食品添加劑使用，CIR專家小組批準在化妝品中的使用濃度限制為0.5%。

1.3 研究現狀

目前，關于o-傘花烴-5-醇含量的檢測方法主要有氣相色譜-質譜聯用法液和高效液相色譜法等。孫宗喜等[7]通過氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術對柴胡根莖中的揮發油成分進行了分析和鑒定。結果顯示，柴胡根和莖兩部位共鑒定出了正己醛、2-戊基呋喃、棕櫚酸、麝香草酚、o-傘花烴-5醇等95中化合物。其中，o-傘花烴-5-醇主要存在于柴胡的根中，采用GC-MS的方法進行定量分析，其含量為8.31%，是柴胡根揮發油中的主要化學成分之一。采用該方法研究得出，甘肅與湖北、河南等地所產柴胡揮發油在化合物種類和揮發油和含量上有較大的差異，為中草藥化學組分的定性定量研究提供了科學的分析手段。

王娟等[8]研究用高效液相色譜儀來檢測洗手液中3-甲基-4-異丙基苯酚(o-傘花烴-5-醇)的含量，該方法操作簡單、準確快速，可以直接配制樣品溶液檢測，不需要樣品前處理。其最低定量檢測濃度為10mg/kg，相關系數R2=0.9997，o-傘花烴-5-醇在1μg/mL～200μg/mL的濃度范圍內線性相關，回收率范圍為98%～100%，相對標準偏差(RSD)為1.125%，表明該方法具有很好的準確度和可靠性。夏澤敏等[9]研究用高效液相色譜法測定化妝水、潔面乳及美白霜等化妝品中o-傘花烴-5-醇的含量，采用甲醇溶解樣品，離心分離并過濾后直接進樣分析，方法操作簡便，準確度高，適用于不同配方體系化妝品中o-傘花烴-5-醇含量的檢測，對規范化妝品中防腐劑的使用及保障消費者的健康安全有著積極的意義。

高效液相色譜法由于對高沸點，強極性，熱不穩定，大分子復雜混合物的分離分析具有氣相色譜法無法比擬的優勢，因而其研究及應用更為廣泛。本方法提出的高效液相色譜測定口腔清潔護理產品中o-傘花烴-5-醇含量的方法，相比其他檢測方法，具有前處理簡單、定性定量準確、檢測結果不易受雜質或色澤干擾等諸多優點，與氣質聯用儀相比，液相色譜儀價格更加低廉，性價比較高，更適合在口腔護理用品生產企業和第三方檢測機構中推廣使用。

2 實驗原理

牙膏樣品用50%甲醇水溶液分散，經超聲提取其中o-傘花烴-5-醇成分，然后離心分離并過濾處理，濾液用帶二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀分析測定，采用外標法，通過峰面積定量計算樣品中o-傘花烴-5-醇的含量。

3 分析條件的選擇與優化

3.1 提取溶劑的選擇

o-傘花烴-5-醇不溶于水，而牙膏試樣在水溶液中經磁力攪拌和超聲提取后，易于分散。若采用純水作為本方法的提取溶劑，雖然可以將牙膏試樣較好地分散，但純水不能起到完全溶解o-傘花烴-5-醇的目的；另外，由于牙膏試樣遇到甲醇會在表面形成硬殼，很難提取到牙膏內部，所以純甲醇溶液也不適合作為本方法的提取溶劑。

所以，既要考慮到可以較好的溶解對照品，又要考慮到可以將牙膏試樣分散并提取其中o-傘花烴-5-醇的目的，本方法最終選用甲醇/水溶液體系作為本方法的提取溶劑。

3.1.1 提取溶劑濃度的確立

由于牙膏中含有大量的增稠劑，用水分散時，水比例大時，一些增稠劑溶于水中，不利于微孔濾膜過濾；水比例小，又不利于牙膏分散均勻。為確定甲醇/水溶液最佳比例，稱取1.0g(精確至0.0001g)牙膏試樣于100mL容量瓶中，用0% ～ 100%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，磁力攪拌至均勻，超聲提取10min后觀察其溶解及分散情況。如表1所示，在50%甲醇水溶液中，o-傘花烴-5-醇對照品為略溶(1g“o-傘花烴-5-醇”在100mL的溶劑中溶解)，且該溶劑也可將牙膏試樣較好的分散開，實驗結果較為理想。

表1 對照品及牙膏試樣的溶解性

3.1.2 提取時間的確立

采用磁力攪拌的方式將牙膏溶液攪拌至均勻，后放入超聲波清洗器中進行超聲提取。超聲提取5min，10min，20min，30min，60min，測定峰面積。實驗結果表明，將試樣溶液超聲10min后，在本方法色譜條件下，o-傘花烴-5-醇的峰面積幾乎沒有變化，可以達到提取平衡，所以最終選擇10min作為本方法牙膏樣品中目標物質的提取時間。

3.1.3 最終選擇的前處理條件

牙膏試樣：先擠去約20mm，再稱取1g(精確至 0.0001g)試樣于100mL燒杯中，用約80mL 50%甲醇水溶液溶解，磁力攪拌至分散均勻，超聲提取10min后，轉移至100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度。搖勻后，將試樣溶液轉移至50mL離心管中，4000r/min以上離心分離10min。冷卻至室溫后，上清液經0.45μm有機相濾膜過濾，備用。

漱口水試樣：稱取1g(精確至0.0001g)試樣于100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度。搖勻后，上清液經0.45μm有機相濾膜過濾，備用。

3.2 檢測器及檢測波長的選擇

液相色譜連接的檢測器有示差折光檢測器、熒光檢測器、質譜檢測器、紫外檢測器等。示差檢測器通用性強、操作簡單，凡是具有與流動相折光率不同的試樣組分，均可使用示差折光檢測器進行檢測，但靈敏度低，流動相、環境溫度的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于需要梯度洗脫試樣的檢測。質譜檢測器靈敏度高，定性定量準確，但價格比較昂貴，難以在中小企業得到推廣。熒光檢測器只適用于具有熒光的有機化合物的檢測，也不適合牙膏中，o-傘花烴-5-醇的檢測。

紫外檢測器是一種比較普及的檢測器，適用于對紫外光或可見光有吸收性能試樣的檢測。其特點：使用面廣、靈敏度高(檢測下限為10g/mL)、對溫度和流速變化不敏感、線性范圍寬、可檢測梯度溶液洗脫的試樣。

按照本方法的色譜條件，在190～400nm下進行紫外掃描，如圖1所示，o-傘花烴-5-醇在195nm、216nm及279nm均有最大的吸收，由于在195nm及217nm波長處如甲醇溶劑等干擾物質吸收較多，出峰情況較為復雜，易對測定結果產生干擾。同時，考慮到牙膏試樣組分復雜，為了能準確測定其含量，選擇279nm作為紫外檢測器的檢測波長。

圖1 對照品o-傘花烴-5-醇的紫外掃描譜圖

3.3 流動相條件的選擇

3.3.1 水相的選擇

在反相色譜中，在流動相中加入磷酸二氫鉀，能使流動相保持一定的離子強度，可改善峰型，減少拖尾。但鹽濃度過高，又容易損傷色譜柱。基于文獻資料，選擇乙腈作為有機相，磷酸二氫鉀緩沖溶液作為水相，比較不同濃度及pH條件磷酸二氫鉀緩沖溶液對o-傘花烴-5-醇峰形的影響。

如表2所示，當磷酸二氫鉀緩沖溶液濃度為10mmol/L時，目標峰的不對稱度為0.99，已經達到了實驗的要求；如表3所示，當pH值在3.5～4.7的范圍內，磷酸二氫鉀緩沖溶液對色譜峰與溶劑峰的分離度沒有明顯的影響，所以，實驗過程中無需在對10mmol的磷酸二氫鉀緩沖溶液的pH值進行調整。綜合表2及表3的實驗結果，本方法流動相中最終選擇的水相條件為：磷酸二氫鉀緩沖溶液(10mmol/L)。

表2 磷酸二氫鉀緩沖溶液濃度對o-傘花烴-5-醇色譜峰不對稱度的影響

表3 不同流動相pH對于實驗結果的影響

3.3.2 有機相的選擇

固定水相為10 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液，分別比較采用有機相乙腈和甲醇時的出峰情況。發現乙腈比甲醇有較好的洗脫性，出峰情況也更佳。故本方法選擇乙腈作為流動相中的有機相。

3.3.3 流動相比例的選擇

調節流動相中有機相與水相的比例可改變“目標物質”出峰的時間及峰形。為此，考察了流動相體系中“乙腈”與“磷酸二氫鉀緩沖溶液(10mmol/L)”的比例對o-傘花烴-5-醇出峰情況的影響。當流動相中乙腈∶磷酸二氫鉀緩沖溶液(10mmol/L)=38∶62(V/V)時，o-傘花烴-5-醇色譜峰與溶劑峰的分離情況較好，o-傘花烴-5-醇的出峰時間約為15.0min左右。綜合考慮各個因素，最終選擇乙腈∶磷酸二氫鉀緩沖溶液(10mmol/L)=38∶62(V/V)時，流量為1.5mL/min時，即可以達到較理想的分離效果。

3.4 色譜條件的優化

按照3.1～3.3確立的色譜條件，對照品色譜圖如圖2所示，分析一個o-傘花烴-5-醇對照品溶液需要的時間為16min。

圖2 對照品液相色譜圖(等度洗脫)

由于牙膏配方體系復雜，在用以上色譜條件分析市售不含o-傘花烴-5-醇的陰性牙膏試樣時發現，在20min左右會有一個很大的“雜質峰”(如圖3所示)；另外，通過分析市售的其他約40款陽性和陰性牙膏試樣的色譜峰發現，在20min左右均會出現該“雜質”色譜峰，說明該“雜質”為牙膏體系中的主要成分，具有普遍性。在本方法中，若將“牙膏試樣”的進樣時間定為16min，則在“牙膏試樣”連續進樣的過程中，牙膏試樣中目標物質的色譜峰會受到前面幾針未出盡的“雜質峰”的影響，從而影響了方法的精密度；若將“牙膏試樣”的進樣時間定為60min以上，則分析時間太長，降低了工作效率。

圖3 陰性牙膏試樣液相色譜圖(梯度洗脫)

所以，在連續進樣時，為了使組分復雜的樣品不干擾下一個樣品檢測，同時，也為了加快分析樣品的時間，使得“等度洗脫”時“20min”出現的“雜質峰”盡快走出色譜柱，采用梯度洗脫的方式(如表4所示)，35min即可分析一個樣品，提高了檢測效率。

表4 梯度洗脫程序

按照表4中的梯度洗脫程序，市售含o-傘花烴-5-醇的牙膏試樣及口腔噴霧劑產品的色譜圖分別如圖4、圖5所示。

圖4 市售某含“o-傘花烴-5-醇”牙膏試樣液相色譜圖(梯度洗脫)

圖5 市售某含“o-傘花烴-5-醇”口腔噴霧劑液相色譜圖(梯度洗脫 )

3.5 最終儀器條件

液相色譜柱參數：Dionex AcclaimTM 120型C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)及配套保護柱(4.0mm×10mm，5μm)；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：279nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。o-傘花烴-5-醇對照品用等度洗脫方式分析，牙膏試樣用梯度洗脫方式分析，洗脫程序如表4。

3.6 方法性能指標

3.6.1 方法的線性關系

分別配制濃度為1.0μg/mL，2.5μg/mL，5.0μg/mL，7.5μg/mL，10.0μg/mL，12.5μg/mL，15.0μg/mL，在本方法的色譜條件下進樣檢測，并以o-傘花烴-5-醇對照品質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標作圖，同時用最小二乘法進行線性回歸，得標準工作曲線及回歸方程見表5，圖6。實驗結果顯示，在1.00～15.0μg/mL的濃度范圍內，對照品質量濃度與峰面積值具有良好的線性關系。

表5 對照品o-傘花烴-5-醇的回歸方程、相關系數和線性范圍

圖6 對照品o-傘花烴-5-醇標準工作曲線

3.6.2 對照品穩定性實驗

配制濃度約為 10.0μg/mL 的o-傘花烴-5-醇對照品溶液，考察對照品濃度在10日內的穩定性。如表6所示，對照品溶液中o-傘花烴-5-醇含量10日內測定結果的RSD為0.75%，說明對照品溶液存放一周后其o-傘花烴-5-醇含量仍然比較穩定。

表6 o-傘花烴-5-醇對照品(10.0μg/mL)10日穩定性實驗

3.6.3 方法的最低檢出濃度和最低定量濃度的確定

將對照品溶液稀釋進樣，測定峰高信噪比為10∶1時o-傘花烴-5-醇濃度確定為方法的定量濃度；測定峰高信噪比為3∶1時添加的o-傘花烴-5-醇濃度確定為方法的檢出濃度。

向不含o-傘花烴-5-醇的陰性牙膏試樣中定量添加標準溶液，按照前處理方法處理后，測定峰高信噪比為10∶1時o-傘花烴-5-醇濃度確定為方法的定量限；測定峰高信噪比為3∶1時添加的o-傘花烴-5-醇濃度確定為方法的檢出限。以上測定結果如表7所示。

表7 方法的檢出限、定量限、檢出濃度和定量濃度

3.6.4 系統適用性實驗

精密吸取同一濃度為 10.0μg/mL 的ο-傘花烴-5-醇對照品溶液，在本色譜條件下，連續6次進樣(等度洗脫)，測定其峰面積及保留時間。結果顯示，ο-傘花烴-5-醇峰面積的RSD為0.20%，保留時間的RSD為0.06%。

3.6.5 方法的精密度

精密稱取某含ο-傘花烴-5-醇的市售牙膏試樣1份，每份約1g(精確至0.0001g)，按前處理條件處理后，連續 6次進樣(梯度洗脫)，測定目標峰其峰面積及保留時間。結果顯示，牙膏中ο-傘花烴-5-醇峰面積的RSD為0.91%，保留時間的RSD為0.36%，牙膏樣品中目標物質含量的RSD為0.92%。

精密稱取某含ο-傘花烴-5-醇的牙膏試樣6份，每份約1g(精確至0.0001g)，按前處理條件處理后，按本方法確定的色譜條件進行測定，測得試樣中ο-傘花烴-5-醇的平均含量為440.1μg/g，RSD為1.63%。

3.6.6 方法的加標回收率

目前國內市售牙膏樣品配方中的磨擦劑體系主要分為碳酸鈣、二氧化硅及磷酸氫鈣三種。為考察本方法對不同磨擦劑體系牙膏樣品的適用性和檢測結果的準確性，選取三種具有代表性的市售陰性牙膏試樣，分別進行低、中、高三個添加水平的加標回收率試驗，按照本方法的前處理條件及色譜條件進行測定，計算回收率，如表8所示，o-傘花烴-5-醇在添加濃度100～400mg/kg范圍內，回收率在98.42%～101.39%之間。

表8 牙膏試樣加標回收率試驗結果

3.6.7 干擾因素的排除

麝香草酚，又名2-異丙基-5-甲基苯酚，是我國《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準(GB2760)》中允許使用的食品香料。在牙膏、漱口水等香精中也會添加使用。麝香草酚與o-傘花烴-5-醇為同分異構體，為考察本方法色譜條件下，麝香草酚的出峰情況是否會對目標物產生干擾，對以上兩種物質進行了色譜分析，考察兩種物質在同一色譜條件下的分離情況。如圖7所示。

圖7 本方法條件下目標物與麝香草酚的分離情況

在本方法色譜條件下，o-傘花烴-5-醇與麝香草酚可以完全分離，所以，樣品中麝香草酚的存在不會影響本方法中目標物質的檢測。

4 結果與討論

4.1 市售口腔護理產品中o-傘花烴-5-醇含量的檢測

牙膏，漱口水等口腔護理產品配方成分復雜，各企業產品配方，所用原料等都不盡相同。為驗證在本色譜條件下，對于不同配方體系牙膏等產品，是否存在影響目標物質檢測的干擾因素，收集了市場上具有代表性的45款牙膏、漱口水和口腔噴霧劑產品。其中1款牙膏及1款口腔噴霧劑包裝的成分表上標注添加“o-傘花烴-5-醇”成分，另外43款產品的成分表上未標注。

檢測結果顯示，1款牙膏中o-傘花烴-5-醇的含量為440.0mg/kg，1款口腔噴霧劑中的含量為185.8mg/kg，另外43款產品中o-傘花烴-5-醇的含量為“未檢出”。以上檢測結果與產品成分信息一致，且符合國家相關法律法規中對于o-傘花烴-5-醇限量使用的要求。同時，也驗證了本方法對于不同配方體系口腔護理產品的適用性。

4.2 方法驗證

為考察在本方法色譜條件下，在不同實驗室及操作環境下實驗結果的平行性和準確性，邀請了3家檢測機構及1家口腔護理用品生產企業的實驗室對本方法的實驗條件進行了驗證。如表8所示，在重復性實驗條件下，四家實驗室標準工作曲線的線性良好，R2在0.9997～0.9999之間；回收率均能滿足標準文本的回收率要求，o-傘花烴-5-醇在添加濃度100mg/kg～400mg/kg范圍內，本標準方法的回收率在96.3%～101.4%之間；方法的精密度良好，相對標準偏差(n=6)在0.41%～1.63%之間；對于同一款牙膏樣品(含o-傘花烴-5-醇)，四家實驗室檢測結果的相對標準偏差為2.06%。

表9 方法驗證情況匯總

5 結論

綜上所述，本法利用高效液相色譜法，對牙膏中的o-傘花烴-5-醇進行了定性、定量的研究。方法具有簡便快捷，具有重復性好，靈敏度高等特點。適用于對口腔護理產品，如牙膏、漱口水、口腔噴霧劑等產品中o-傘花烴-5-醇含量的檢測和控制，為生產企業和質量檢測機構提供了科學有效的檢測方法，對規范口腔護理產品中防腐劑的使用，及保護消費者的健康安全有著積極的意義。