測定龍膽草提取液中龍膽苦苷含量方法的建立

胡永志 黃 靜 劉文佳 梁雪松 黃光偉

(柳州兩面針股份有限公司，廣西 柳州 545001)

引言

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽Gentiana manshurica Kitag.、龍膽Gentiana scabra Bge.、三花龍膽Gentiana triflora Pall或堅龍膽Gentiana rigescens Franch.的干燥根和根莖。龍膽草在中藥制劑中使用非常廣泛，且用量較大。目前藥典中規定，龍膽草的藥用部位為干燥根[1-2]，而大量的莖、葉、花則棄之。研究發現其根及根莖含有裂環環烯醚萜苷、生物堿、黃酮、甾體、香豆素及內酯等化合物[3]。其中龍膽苦苷含量最高，被《中國藥典》定為質量標準控制的目標成分[4]。龍膽苦苷為環烯醚萜類化合物，現代藥理學研究表明其具有保肝、利膽、健胃、抗炎、抗菌等功效[5-8]。本研究采用高效液相色譜法測定龍膽提取液中龍膽苦苷的含量，為龍膽提取液中龍膽苦苷含量的檢測提供可靠的手段，以期為開發該藥材藥用價值提供參考依據。

1 儀器與材料

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀系統(G7129A 1260Vialsampler, G7111 1260 Quat Pump VL, G7114A 1260VWD)；梅特勒-托利多ML204型電子天平；天津奧特賽恩斯儀器有限公司AS3120型超聲波清洗器；梅特勒-托利多FE20型實驗室pH計；龍膽苦苷對照品，中國食品藥品檢定研究所(含量以97.6%計)；Fisher chemical色譜純甲醇；超純去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相為乙腈(B)-水(A)，流動相梯度如下表1所示；流速為1mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長為270 nm；進樣量20 μL。按此色譜條件下測定，龍膽提取液樣品色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取龍膽苦苷對照品0.01 g，置50mL容量瓶中，加入適量甲醇，振蕩溶解，再加甲醇至刻度，搖勻，備用。

2.3 供試品溶液的制備

準確稱取龍膽提取液0.1 g，置10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，濾液為供試品溶液。

2.4 標準曲線的繪制

精密量取2.2龍膽苦苷對照品儲備液2、4、6、8、10mL分別置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，依前述色譜條件進行測定。以峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程：

Y=13.8381X+7.3008

r=0.99991

結果表明，龍膽苦苷濃度在40～200μg/mL時與峰面積有良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取龍膽提取液制備的供試品溶液，依前述色譜條件連續進樣6次，測定龍膽苦苷含量，結果見表2。6次進樣測得樣品龍膽苦苷含量平均值為1.6727，RSD為0.48%，結果表明，該方法精密度良好。

表2 精密度試驗結果

2.6 穩定性試驗

取龍膽提取液制備的供試品溶液，依前述的色譜條件在0、0.5、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、24.0 h分別進樣，測定龍膽苦苷含量，結果見表3。結果表明，在24小時內供試品溶液穩定性良好，平均值為1.6611，RSD為0.69%。

表3 穩定性試驗結果

2.7 重現性試驗

取同一瓶龍膽提取液平行稱取樣品6份，依照2.3分別制備供試品溶液，進樣測定，結果見表4。計算得龍膽提取液中龍膽苦苷平均含量為1.6682，RSD為0.43%，表明分析方法重現性良好。

表4 重現性試驗結果

2.8 回收率試驗

精密稱取已知含量的龍膽提取液6份行樣，分別精密加入不同量的龍膽苦苷對照品，攪勻，依照2.3制成供試品溶液，按上述方法進行測定，計算加標回收率，結果見表5。其平均回收率為99.78%，表明本方法準確可靠。

表5 回收率試驗結果

2.9 樣品測定

取龍膽提取液6批，依照2.3分別制備供試品溶液，進樣測定龍膽苦苷含量，每批檢測3次，計算其平均值，結果見表6。

表6 牙膏中龍膽苦苷含量測定結果

3 討論

經反復實驗最終確定使用Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為乙腈-水，檢測波長為270 nm，柱溫為35 ℃，流速為1mL/min，在此條件下龍膽苦苷色譜峰分離較為理想。采用本方法測定龍膽提取液中龍膽苦苷含量，樣品處理方法簡便，流動相組成簡單，龍膽苦苷濃度在40～200μg/mL與峰面積成良好的線性關系(r=0.99991)，平均加標回收率為99.78%，能準確測定龍膽提取物中龍膽苦苷的含量，為控制該藥材質量提供了可靠的方法。