桃紅四物湯對CCl4誘導肝纖維化小鼠模型的干預作用及其機制

劉旭凌，楊廣越，張 瑋，孫田甜，馬文婷，吳 柳，薛冬英，劉 成a,，陶 樂

上海中醫藥大學附屬普陀醫院 a.肝病實驗室，b.感染科，c.中心實驗室，上海 200062

肝纖維化是各種慢性肝病進展為肝硬化的中間過程，抗纖維化可在一定程度上阻止肝硬化、肝細胞癌的發生[1]。肝纖維化主要是肝內細胞外基質(ECM)增生與降解失衡。肝星狀細胞(HSC)是ECM產生的細胞學基礎，有效抑制HSC活化對抗纖維化治療有重要意義。研究顯示中藥可以改善抑制肝纖維化患者肝組織病理學進展、減少肝硬化靜脈曲張出血發生率等。出自經典方劑的“桃紅四物湯”是養血活血方藥，對肝纖維化等肝臟疾病具有良好的治療效果[2]，桃紅四物湯及方中桃仁、紅花、川芎、當歸等單味藥均顯示出明顯的抗肝纖維化作用[3-4]，但其機制尚未明確。

透明質酸(HA)主要存在ECM中，是肝纖維化的重要標志物。HA合成酶(hyaluronan synthase，HAS)是合成HA的重要分子，其中HAS-2可以催化合成高分子量HA，是抗肝纖維化的重要靶點[5-6]。本研究通過建立CCl4小鼠模型，探討桃紅四物湯對CCl4所致肝纖維化的干預作用，進一步以HAS-2為切入點，研究探討桃紅四物湯抗肝纖維化的作用機制，以期為桃紅四物湯治療肝纖維化提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性C57BL/6小鼠24只，清潔級，6～8周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證號：SYXK(滬)2019-0006。所有小鼠均飼養于上海大學生命科學院實驗動物中心，使用許可證號：SYXK(滬)2019-0020。飼養室溫度(22±1)℃，相對濕度30%～60%，12 h光照/12 h黑暗，適應性喂養1周，動物自由進食和飲水。

1.1.2 藥物與試劑 參照2020年版《中華人民共和國藥典》規定，采用道地藥材，生藥學專家鑒定。統一由上海中醫藥大學中藥制劑中心一次制備后冷凍干燥保存。桃仁9 g，紅花6 g、當歸15 g、熟地黃15 g、川芎8 g、白芍10 g均購自上海華宇藥物有限公司，制成粗粉末后以75%乙醇提取2次，提取液濃縮成浸膏(THSWD)，真空干燥后冷藏保存。主要試劑：ALT、AST檢測試劑盒(C009-2、C010-2-1)，購自南京建成生物工程研究所；SABC免疫組化試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司；α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA，ab5694)、HAS-2、ab140671購自Abcam公司；Ⅰ型膠原(Col1，NB600-408)購自Novus，GAPDH(AP0063)購自Bioworld；引物(α-SMA、Col1α1、HAS-1、HAS-2、HAS-3)由上海生工生物科技有限公司合成；RNA提取試劑Trizol(9109)、cDNA 逆轉錄試劑盒(RR037A)及SYBR(RR420)均購自Takara公司；DAB購自北京中杉金橋(ZLI-9018)；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Scientific公司(23227)；PVDF膜購自Merck Millipore公司(IPVH00010)。

1.1.3 儀器 多功能酶標儀(Thermo Varioskan LUX)，超微量分光光度計(Berthold Detection Systems，colibri)，普通PCR儀(Bio-RAD，T100)，實時熒光定量PCR(RT-PCR)儀(ABI，VIIA 7 DX)，電泳儀(Bio-Rad，PowerPacTM Basic 041BR127719)，化學發光凝膠成像分析系統(上海培清科技有限公司，JS-1060)，半自動輪轉式切片機(RM2245)，自動脫水機(TP1020)，包埋機(EG1150H)，全自動染色機(ST5010)，自動封片機(CV5030)均購自Leica公司，熒光顯微鏡購自Olympus公司(BX43)。

1.2 研究方法

1.2.1 分組、造模和給藥 24只小鼠隨機分為正常組、模型組和桃紅四物湯組，每組8只。模型組和桃紅四物湯組小鼠腹腔注射10% CCl4，0.04 ml/只，每周3次，連續6周；正常組小鼠相同時間腹腔注射等體積橄欖油。造模第3周起，桃紅四物湯組按照成人體質量(70 kg)10倍的量，每日1次灌胃，正常組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續4周。

1.2.2 標本采集 藥物干預4周后，各組小鼠禁食不禁水12 h，麻醉小鼠后腹主動脈采血，血液靜置1 h后3000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，取血清，隨后取小鼠肝組織進行后續實驗。

1.2.3 肝功能指標檢測 參照試劑盒說明書步驟檢測各組小鼠血清ALT、AST水平。

1.2.4 肝組織病理學觀察 選取肝右側最厚一葉，切取0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm大小肝組織1塊，10%中性福爾馬林固定，自動脫水機逐級酒精脫水、二甲苯透明，包埋、4 μm切片，觀察組織的病理變化。HE染色觀察組織學損傷。天狼星紅染色：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水5 min×3次，滴加天狼星紅染色液，30 ℃孵育30 min，無水乙醇沖洗，晾干后封片。免疫組化染色：石蠟切片脫蠟至水，1%檸檬酸鈉抗原修復，3%H2O2室溫孵育5～10 min，PBS清洗，3 min×3次，5%BSA封閉30 min，一抗抗體α-SMA、HAS-2 4℃孵育過夜，PBS清洗，3 min×3次。滴加北京中杉試劑盒中相應二抗，37 ℃孵育20 min，PBS清洗，3 min×3次；第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS清洗，3 min×3次。顯色劑顯色(DAB或AEC)。自來水充分沖洗，蘇木素復染，封片。采用Image-pro plus 6.0分析病理圖片的陽性染色區域。

1.2.5 總RNA提取 Trizol法提取肝臟RNA，將提取的總RNA溶解于DEPC水，測RNA濃度。逆轉錄：按Takara逆轉錄試劑盒(RR037A)說明書進行。以18S為內參，擴增引物由引物原液與滅菌水合成。反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 15 min。擴增：取cDNA 3 μL加SYBR Green 5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 1.2 μL，制成10 μL體系，反應條件為：95 ℃、30 min預變性，95 ℃、5 s變性，60 ℃、30 s退火，40個循環，60 ℃、1 min延伸。PCR結束采用2-ΔΔCt法分析計算目的基因表達。

1.2.6 纖維化及相關因子的表達 RT-PCR檢測α-SMA、Col1、Has-1、HAS-2和HAS-3的mRNA表達水平，引物由上海生工生物科技有限公司合成，序列見表1。Western Blot檢測α-SMA、Col1、蛋白的表達。將0.1 g肝組織加入預冷的RIPA(含蛋白酶抑制劑)勻漿，4 ℃下10 000 r/min離心15 min，取上清。蛋白定量，取20 μg樣品，10% SDS-PAGE電泳，100 V轉移1 h至PVDF膜，封閉1 h；一抗α-SMA和Col1，4 ℃過夜，鼠二抗(1∶5000)/兔二抗(1∶5000)室溫孵育60 min，ECL顯影，采用Image J分析Western Blot的蛋白表達灰度值。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.7 小鼠原代HSC分離 C57BL/6小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，仰臥位固定四肢，剖開腹部暴露門靜脈及下腔靜脈，將24G留置針插入門靜脈，將前灌流液25 mL以5 mL/min的速度充分灌注約5 min至肝臟變為均勻的土黃色；更換為0.2 g/L鏈霉蛋白酶溶液(含25 mL)灌注約5 min，再更換為0.3 g/L的Ⅳ型膠原酶溶液(30 mL)灌注約5 min；灌流完畢后摘除肝臟，剔除肝包膜及膽囊，輕柔撕碎肝組織，將肝組織移入分散液(30 mL)，37 ℃搖床消化15 min，用100 μm孔徑的過濾肝組織懸液，加入20%胎牛血清2 mL終止消化。細胞懸液37 ℃、1700 r/min離心5 min，棄上清，取沉淀細胞，加入30 mL無血清GBSS/B懸混勻后再次37 ℃、1700 r/min離心5 min，棄上清，加入10 mL MEM培養基、1.5 mL DNA酶Ⅰ、8.5 mL 28.7%密度梯度分散液(Nycodenz)混勻成細胞懸液，用移液槍緩慢鋪10 mL GBSS/A，24 ℃ 1450 g離心22 min，離心后可見細胞分層，吸取中間白膜層細胞，加入無血清MEM培養基，1700 r/min 離心5 min重復2次清洗細胞碎片，最終將細胞重懸加入20%胎牛血清的DMEM培養。

1.2.8 細胞培養 桃紅四物湯處理細胞參照本課題組既往文獻[7]方法。分離原代HSC，培養于DMEM-10%胎牛血清-2%雙抗培養基，24 h后換液，48 h后進行實驗。轉染siRNA：細胞饑餓處理6 h，配制Opti-MEN+LTX+si-RNA質粒(終濃度100 pmol)混合液。靜置20 min后將混合液加到培養皿中，處理6 h后換成DMEM-10%胎牛血清+1%雙抗培養液，培養細胞48 h后處理。TGFβ使用終濃度為5 ng/mL。

1.3 倫理學審查 本研究方案經上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批，批號：PTEC-A-2016-4(G)-1。符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 桃紅四物湯治療CCl4肝纖維化小鼠肝損傷 與正常組小鼠相比，模型組小鼠ALT、AST水平均升高(P值均<0.01)；而桃紅四物湯組與模型組相比小鼠血清ALT、AST均顯著降低(P值均<0.01)(表2)。

HE染色結果顯示：正常組肝細胞索從中央靜脈呈放射狀排列，模型組小鼠肝小葉間炎性細胞浸潤明顯，桃紅四物湯可顯著抑制炎性浸潤(圖1a)。桃紅四物湯組肝臟炎性細胞面積較模型組明顯減小(P<0.01)(表2)。天狼星紅染色結果顯示：正常組小鼠肝組織僅在匯管區和中央靜脈壁可見少量膠原纖維，模型組小鼠肝組織可見增生的膠原纖維分割肝小葉形成較粗大的間隔，部分假小葉形成；桃紅四物湯組小鼠肝組織纖維間隔較窄、排列疏松且不連續(圖1b)。與模型組相比，桃紅四物湯組天狼星紅面積顯著減少(P<0.01)(表2)。

表2 各組血清轉氨酶水平及病理學改變

注：a，HE染色，×100；b，天狼星紅染色，×100。

2.2 各組α-SMA、Col1 mRNA和蛋白表達情況 RT-PCR結果顯示：與模型組相比，桃紅四物湯組α-SMA、Col1 mRNA的表達水平均顯著降低(P值均<0.001)；免疫印跡結果顯示：與模型組相比，桃紅四物湯組α-SMA、Col1 蛋白的表達水平均顯著降低(P值均<0.001)。免疫組化結果顯示：在正常組小鼠肝組織中α-SMA陽性表達僅存在于匯管區動靜脈血管壁上；CCl4模型組小鼠α-SMA呈強陽性表達，密布于匯管區，炎癥浸潤區及膠原纖維增生處，沿假小葉結構分布；桃紅四物湯組α-SMA陽性表達主要存在于匯管區血管壁，肝竇處亦有分布，陽性表達水平較模型組明顯減少(P<0.01)(圖2，表3)。

表3 各組α-SMA、Col1表達水平比較

注：a，α-SMA免疫組化結果(×100)；b，α-SMA、Col1免疫印跡結果。

2.3 各組HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA和HAS-2蛋白表達情況 與正常組比較，模型組肝組織中HAS-2 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，而HAS-1、HAS-3表達水平均無顯著變化(表4)(P值均>0.05)。進一步通過免疫組化發現：HAS-2分布于變性的肝細胞，纖維化區，肝竇區、匯管區，血管壁；桃紅四物湯組HAS-2陽性表達水平(0.29±0.10)較模型組(1.00±0.12)明顯減少(t=70.73，P<0.001)，免疫印跡結果與免疫組化結果一致(圖3)。

表4 各組HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA表達情況

注：a，HAS-2免疫組化結果(×100)；b，HAS-2免疫印跡結果。

2.4 桃紅四物湯調控HSC HAS-2表達發揮抗肝纖維化作用 在分離小鼠原代HSC，TGFβ(5 ng/ml)處理HSC 48 h后，TGFβ處理組的α-SMA、Col1、HAS-2 mRNA表達水平均較對照組(PBS處理)顯著升高(P值均<0.01)(表5)。

表5 α-SMA、Col1、HAS-2 mRNA在原代HSC中的表達水平

與NC組相比，TGFβ處理后(NC+TGFβ組)，α-SMA、Col1 mRNA表達水平顯著升高(P值均<0.01)，桃紅四物湯處理后(NC+TGFβ+THSWD組)，α-SMA、Col1 mRNA表達水平較NC+TGFβ組顯著降低(P值均<0.01)；siRNA沉默HAS-2，TGFβ處理后(Si HAS-2+TGFβ組)α-SMA、Col1 mRNA表達水平較NC+TGFβ組顯著降低(P值均<0.01)，而桃紅四物湯處理后(Si HAS-2+TGFβ+THSWD組)，與Si HAS-2+TGFβ組相比，α-SMA、Col1 mRNA表達水平無明顯變化(P值均>0.05)(表6)。

表6 基因沉默HAS2檢測THSWD對HSC活化的影響

3 討論

肝纖維化形成過程和機制復雜，影響因素眾多，中醫辨證認為肝纖維化的病機主要是“氣虛、血瘀”。目前研究[8-10]發現一些中成藥具有顯著的抗肝纖維化作用。經典方劑桃紅四物湯的主要功效是“養血活血”，與肝纖維化的病機相鍥合，已有報道[2]顯示該方對臨床慢性肝病有良好的治療效果，但其機制尚未明確。

各種病因均可繼發性激活HSC導致肝纖維化[11]。肝纖維化的發生主要是由于ECM的增生與降解失衡，導致ECM過度沉積[12]，而HA是ECM的重要組成部分[6]。相對于催化合成高分子量和短鏈HA的HAS-1、HAS-3，催化合成低分子量的HAS-2是細胞合成HA的關鍵酶，在ECM組成中起主要作用[13]，在HSC活化中HAS-2可通過TGFβ信號通路調節肝纖維化[14]，為此本研究進一步通過桃紅四物湯干預CCl4肝纖維化模型，結合分離培養小鼠原代HSC，探究桃紅四物湯在抗肝纖維化過程中HAS-2發揮的作用。結果顯示，CCl4肝纖維化模型組小鼠ALT、AST水平明顯升高，在桃紅四物湯干預后肝功能指標得到恢復，表明桃紅四物湯具有保護小鼠肝損傷的作用。HE及天狼猩紅染色結果提示桃紅四物湯可有效減輕CCl4模型小鼠的肝損傷，改善肝組織炎癥及減輕纖維化；免疫組化結果顯示，CCl4模型組小鼠α-SMA呈強陽性表達于匯管區，炎癥浸潤區及膠原纖維增生處，沿假小葉分布，而桃紅四物湯組α-SMA陽性表達量較CCl4模型組明顯減少。提示桃紅四物湯可有效減輕CCl4模型組小鼠肝損傷，改善肝組織炎癥及減輕纖維化。RT-PCR和免疫印跡結果證實了桃紅四物湯的有效性，其作用與抑制HSC活化密切相關。

HA是一種重要的氨基聚糖，是ECM的主要成份，也是肝纖維化的重要標志物。HA合酶家族的3種成員(HAS-1、HAS-2、HAS-3)均可合成HA[14]，其中活性最低、作用較弱的是HAS-1，主要功能是合成高分子量的HA；HAS-2活性較強，合成低分子量HA；而短鏈HA由活性最強的HAS-3合成。研究[15]表明，在HA以及ECM形成的過程中，HAS-2作為關鍵酶參與；在肝纖維化患者中，HA和HAS-2的表達升高。本研究顯示，在CCl4模型組中HAS-2 mRNA的表達顯著升高，而HAS-1、HAS-3 mRNA的表達無顯著變化，CCl4模型組的HAS-2表達廣泛分布于纖維間隔；而免疫印跡和RT-PCR結果均顯示桃紅四物湯組HAS-2表達均顯著降低，表明桃紅四物湯抗肝纖維化作用可能通過調控HAS-2表達實現。TGFβ可誘導HSC的HAS-2表達及纖維化指標表達顯著升高。桃紅四物湯可顯著抑制TGFβ誘導的小鼠HSC活化和纖維化的表達，但基因沉默HAS-2后，桃紅四物湯不能有效抑制HSC活化，表明桃紅四物湯抑制HSC活化和肝纖維化是通過調控HAS-2實現的。

綜上所述，桃紅四物湯可改善肝功能和減輕肝纖維化，其機制可能是通過調控HSC的HAS-2信號通路發揮作用。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：劉旭凌負責課題設計，資料分析，撰寫論文；楊廣越、張瑋、孫田甜、馬文婷、薛冬英、吳柳參與收集數據，修改論文；劉成、陶樂負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。