蒼術酮對肝癌HepG2細胞活性、凋亡的影響及其相關機制

楊雪麗，薛建華，陳天陽，平 鍵，侯天祿，陳建杰,，成 揚,

1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院 肝病研究所，上海 201203；2 上海浦東新區傳染病醫院 肝病科，上海 201299

肝癌是最常見的惡性腫瘤性疾病，據統計，2020年全球新增肝癌患者90.6萬人(在所有新發癌癥的占比4.7%)，居全部癌癥發病第6位，有83萬人死于肝癌(在所有癌癥中占比8.3%)，居全部癌癥死亡第3位[1]。在我國，肝癌的發病率和死亡率均占全球總數的50%以上，占亞洲總數的70%左右[2]。近年來，盡管肝癌的早期診斷技術和治療水平不斷提高，但患者的5年生存率仍不理想[3]。早期肝癌患者治療方法有切除、肝移植或消融治療等，但由于肝癌起病隱匿，一旦確診常是晚期，晚期肝癌患者由于腫瘤負荷較大(伴有血管侵犯和肝外轉移)，介入治療、消融治療和放療效果有限，肝癌治療指南對晚期肝癌推薦全身系統性治療[4-6]。中醫藥的治療可貫穿肝癌治療的全過程，在改善患者臨床癥狀，減少術后復發和轉移，提高患者生存質量等方面發揮著良好的協同作用[7]。近年來，中藥及中藥有效成分已成為開發新型抗肝癌藥物的重要來源[8]。蒼術酮(Atractylone)是一種從蒼術(Atractylodeslancea)和北蒼術(Atractylodeschinensis)中分離出來的倍半萜類成分，現代藥理表明蒼術酮具有多種藥理活性，如改善潰瘍病灶血液循環、利尿、抗炎、抗腫瘤、保肝、降血糖、抗菌、抗病毒和調節免疫等作用[9-10]。本實驗探討蒼術酮對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的作用及其作用機制，為蒼術酮的進一步開發利用提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細胞株 肝癌HepG2細胞購自中國科學院上海細胞庫，目錄號為SCSP-510，由上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝病研究所負責傳代，培養。

1.1.2 藥物 蒼術飲片購自上海華東藥業公司，由浙江中醫藥大學鑒定，標本(編號y20141022)存放于浙江醫學院藥學系。

1.1.3 試劑 胎牛血清(FBS，美國Gibco公司，批號10437-028)；二甲基亞楓溶液(DMSO，上海源葉生物科技公司，批號20170204)；高糖培養基(DMEM)，青霉素-鏈霉素溶液(美國Hyclone公司，批號分別為SH3002201，sv30010)；RIPA裂解液，胰酶細胞消化液，BCA蛋白濃度測定試劑盒，SDS-PAGE凝膠(上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為P0013B，C0201，P0012，P0012A)；MTT試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號M1020)；Annexin V-FITC凋亡試劑盒(美國BD公司，批號為559763)；B細胞淋巴瘤因子(Bcl-2)，Bcl-2相關x蛋白(Bax)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(武漢華美生物工程有限公司，批號分別為CSB-E08853h，CSB-E09344h，CSB-E13911h)；半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3，英國Abcam公司，批號ab13847)。

1.1.4 儀器 多功能酶標儀，轉膜儀(美國Bio-Rad公司，型號分別為iMark，1704150)；odyssey紅外熒光成像系統(美國LI-COR公司，型號9120)；CO2培養箱(美國Thermo公司，型號51030286)。

1.2 方法

1.2.1 蒼術酮的制備 采用超臨界二氧化碳萃取法對蒼術酮進行提取，按照本課題組前期經驗進行[11]。

1.2.2 細胞培養與分組 HepG2細胞在含10%FBS和1%雙抗的培養基中培養，置于37 ℃，5%CO2的培養箱中孵育，待細胞生長密度達到80%時，用胰酶消化傳代培養。實驗分為4組：空白對照組，蒼術酮低劑量組(5 μmol/L)、中劑量組(10 μmol/L)、高劑量組(20 μmol/L)。

1.2.3 MTT法檢測HepG2細胞活性 將HepG2細胞懸液以每孔100 μL接種于96孔板中(1×104/孔)，孵育過夜。蒼術酮用藥組分別加入含有不同濃度的蒼術酮(5、10、20 μmol/L)的溶液，對照組加入等體積的0.1%DMSO。分別孵育24、48、72 h，孵育結束后加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在培養箱中孵育4 h。實驗結束后，吸棄上清液，加入150 μL DMSO，37 ℃條件下震蕩10 min溶解沉淀。使用酶標儀測定細胞在570 nm處的吸光度(OD值)。

1.2.4 流式細胞術檢測HepG2細胞凋亡 將HepG2細胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔)，分組培養24 h，收集細胞并用預冷的PBS洗滌細胞2次。根據Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明書對細胞進行染色，并通過流式細胞儀檢測凋亡細胞。

1.2.5 流式細胞術檢測HepG2細胞線粒體膜電位 將HepG2細胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔)，培養箱中孵育過夜。待細胞貼壁后分組培養24 h，培養結束后，使用PBS洗滌2次。加入1 mL Rhodamine 123(5 μg/mL)溶液，培養箱中孵育30 min，使用預冷的PBS洗滌細胞2次，流式細胞儀檢測線粒體膜電位。

1.2.6 DCFH-DA法檢測HepG2細胞內活性氧(ROS)水平 將HepG2細胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔),待細胞貼壁后分組培養48 h，培養結束后，使用PBS洗滌2次，更換DCFH-DA培養基，按照ROS試劑盒說明書進行后續操作，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。

1.2.7 蛋白質印跡法檢測各組細胞中Bcl-2、Bax及Cleaved caspase-3的表達 將HepG2細胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔)，在培養箱中孵育過夜。吸棄舊液，分組培養48 h，PBS洗滌細胞2次，使用含有PMSF的RIPA裂解液提取細胞的總蛋白質，收集的細胞在4 ℃下以1000g離心25 min。BCA試劑盒測定細胞蛋白濃度，SDS-PAGE電泳和抗體孵育，ECL化學發光試劑顯色使蛋白質條帶可視化，獲取Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3和GAPDH[12]的條帶圖片，并在Image J系統6.0版本下進行定量分析。

1.2.8 Transwell實驗檢測蒼術酮對HepG2細胞遷移和侵襲的影響 取對數期生長的HepG2細胞給予不同濃度的蒼術酮分組培養24 h。收集細胞，離心，將HepG2細胞懸液按200 μL/室(5×104/孔)加入Transwell小室的上室，同時將500 μL含10%FBS的培養基加入到下室，于37 ℃、5%CO2培養箱內孵育24 h。吸棄培養基，并棄去上室未遷移的細胞，用預冷的95%乙醇固定10 min，0.1%結晶紫染色15 min，光學顯微鏡下觀察，隨機選擇5個視野計數遷移的細胞數量。

2 結果

2.1 蒼術酮對HepG2細胞增殖抑制的影響 蒼術酮處理肝癌HepG2細胞24、48、72 h后，MTT法檢測HepG2細胞活性。在蒼術酮處理細胞24、48 h后，與對照組同一時間相比，蒼術酮低、中、高劑量組的細胞活性呈下降趨勢，且差異均有統計學意義(P值均<0.05)(圖1)。此外，蒼術酮處理HepG2細胞72 h的半數抑制率(IC50值)為26.19 μmol/L(圖1)。

2.2 蒼術酮對HepG2細胞凋亡的影響 對照組和蒼術酮低、中、高劑量組的細胞凋亡率分別為0.32%、14.34%、29.32%和50.12%，HepG2細胞凋亡率隨著蒼術酮藥物濃度的增加而升高，與對照組比較，差異均有統計學意義(P值均<0.05)；中、高劑量組細胞的凋亡率，與低劑量組比較，差異亦有統計學意義(P值均<0.05)(圖2)。

圖2 蒼術酮對HepG2細胞凋亡率的影響

2.3 蒼術酮對HepG2細胞線粒體膜電位丟失的影響 如圖3所示，對照組有5.65%的細胞丟失膜電位，蒼術酮低、中、高劑量組分別有10.5%、16.5%和19.2%的細胞損失線粒體膜電位，4組間差異無統計學意義(P>0.05)。

注:a,對照組；b，5 μmol/L組；c,10 μmol/L組；d,20 μmol/L組。

2.4 蒼術酮對HepG2細胞內ROS水平的影響 如圖4所示，對照組HepG2細胞中ROS的熒光強度較低，經不同濃度的蒼術酮處理后，與對照組比較，蒼術酮低、中、高劑量組HepG2細胞中ROS的熒光強度明顯升高(P值均<0.05)。

注:a,對照組；b，5 μmol/L組；c,10 μmol/L組；d,20 μmol/L組，e，蒼術酮對HepG2細胞內ROS水平定量分析。

2.5 蒼術酮對HepG2細胞遷移的影響 如圖5和表1所示，在對照組中，大量的HepG2細胞從上室遷移到下室，在蒼術酮處理HepG2細胞48 h后，隨著蒼術酮藥物濃度的增加，對HepG2細胞遷移抑制效應也逐漸增加。與對照組比較，蒼術酮低、中、高劑量組的細胞遷移數量明顯降低(P值均<0.05)；中、高劑量組的細胞遷移數量明顯低于低劑量組(P值均<0.05)。

表1 蒼術酮對HepG2細胞遷移的影響

注:a,對照組；b，5 μmol/L組；c,10 μmol/L組；d,20 μmol/L組。

2.6 蒼術酮對HepG2細胞Bcl-2，Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達的影響 如圖6所示，與對照組比較，蒼術酮低、中、高劑量組能顯著抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達，促進凋亡因子Bax和Cleaved caspase-3的表達，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。對照組和蒼術酮用藥組的Bax/Bcl-2蛋白的比率分別為0.20、0.31、1.60、3.78。

圖6 蒼術酮對HepG2細胞中Bcl-2，Bax和Cleaved caspase-3 蛋白表達水平的影響

3 討論

古代文獻并無“肝癌”病名，根據該疾病的典型特征和臨床表現，可將其歸屬于中醫“癥瘕”“脅脹”“肝積”“伏梁”“黃疸”“肝著”“積聚”等[7]。蒼術是多年生菊科植物蒼術的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸脾、胃、肝經，有燥濕健脾、祛風散寒、明目等功效，常用于治療濕阻中焦、脘腹脹滿、泄瀉、水腫、風濕痹痛、風寒感冒、夜盲、眼干澀等病癥[13]，有研究[14]報道蒼術對肺癌、胃癌、食管癌、膽管癌、肝癌等有抑制作用，表現出抗腫瘤的藥理活性。蒼術酮是從蒼術中分離出來的倍半萜類化合物，是中藥蒼術的有效成分之一，周域等[15]研究發現蒼術酮能與維甲酸β受體緊密結合，產生維甲酸樣抗腫瘤作用。耿煒等[16]研究發現蒼術酮能抑制結直腸癌細胞HT29細胞的增殖，并促進細胞凋亡，有抗結直腸癌的作用。本研究主要探討蒼術酮對肝癌HepG2細胞凋亡和遷移的作用和其可能作用機制，為蒼術酮應用與肝癌的臨床應用提供理論依據。

細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡，是由外界刺激因素誘發后，經一系列基因活化及調控細胞有序的、自主的主動死亡過程[17]，細胞凋亡在細胞發育、組織穩態以及對抗有害和潛在危險細胞的防御機制中發揮著重要作用，線粒體信號通路在細胞凋亡中發揮著較為重要的作用[18]。線粒體損傷的特征是線粒體膜電位的丟失使膜通透性增加，線粒體中細胞凋亡因子如細胞色素C釋放到細胞質中，在細胞質中形成凋亡復合物，誘導細胞凋亡[19]。此外，ROS可促進細胞色素C從線粒體上解離，因此ROS水平升高可進一步介導線粒體途徑細胞凋亡[20]。本研究表明蒼術酮可顯著促進肝癌HepG2細胞凋亡，并誘導線粒體膜電位的丟失，增加肝癌HepG2細胞內ROS水平，進一步促進線粒體膜通透性增加和線粒體膜電位的丟失。

研究[21]表明，在眾多的凋亡相關基因中，Bcl-2基因家族在凋亡過程中起重要調節作用，它可以在細胞周期的任何階段直接抑制細胞凋亡，延長細胞存活周期并誘發細胞癌變[22]。在正常狀態下，Bax存在于細胞質中并與Bcl-2結合形成異二聚體，從而使促凋亡蛋白穩定于細胞質中，并抑制細胞凋亡[23]。Bax/Bcl-2的比率是誘導細胞凋亡作用強弱的關鍵因素[24-25]，若Bcl-2蛋白的含量相對下降，Bax將移位于線粒體膜上，刺激線粒體釋放促凋亡因子，激活caspase級聯反應，誘導細胞凋亡[26]。Caspase-3是caspase家族中參與細胞凋亡的關鍵蛋白酶之一，并位于細胞凋亡信號傳導通路的中心位置，Cleaved caspase-3是裂解后的caspase-3，是誘導凋亡的關鍵因子，是反映細胞凋亡可靠的指標[27-28]。本研究表明蒼術酮顯著增加促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-3的表達水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。這些結果表明，蒼術酮可能是通過降低線粒體膜電位，增加細胞內ROS水平，誘導的細胞凋亡。

綜上所述，本研究表明蒼術酮對HepG2細胞具有體外其抑制活性、遷移的作用，并通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。該研究結果為后續蒼術酮在體內對肝癌活性的研究和進一步研究其抑制腫瘤遷移的作用機制提供實驗基礎，并為蒼術酮治療肝癌的臨床應用提供參考。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：楊雪麗、薛建華、陳天陽負責課題設計，實驗操作及撰寫論文；平鍵、侯天祿負責課題設計，擬定寫作思路，修改論文；陳建杰、成揚指導撰寫文章并最后定稿。