蒼術(shù)酮對肝癌HepG2細(xì)胞活性、凋亡的影響及其相關(guān)機制

楊雪麗，薛建華，陳天陽，平 鍵，侯天祿，陳建杰,，成 揚,

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝病研究所，上海 201203；2 上海浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院 肝病科，上海 201299

肝癌是最常見的惡性腫瘤性疾病，據(jù)統(tǒng)計，2020年全球新增肝癌患者90.6萬人(在所有新發(fā)癌癥的占比4.7%)，居全部癌癥發(fā)病第6位，有83萬人死于肝癌(在所有癌癥中占比8.3%)，居全部癌癥死亡第3位[1]。在我國，肝癌的發(fā)病率和死亡率均占全球總數(shù)的50%以上，占亞洲總數(shù)的70%左右[2]。近年來，盡管肝癌的早期診斷技術(shù)和治療水平不斷提高，但患者的5年生存率仍不理想[3]。早期肝癌患者治療方法有切除、肝移植或消融治療等，但由于肝癌起病隱匿，一旦確診常是晚期，晚期肝癌患者由于腫瘤負(fù)荷較大(伴有血管侵犯和肝外轉(zhuǎn)移)，介入治療、消融治療和放療效果有限，肝癌治療指南對晚期肝癌推薦全身系統(tǒng)性治療[4-6]。中醫(yī)藥的治療可貫穿肝癌治療的全過程，在改善患者臨床癥狀，減少術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高患者生存質(zhì)量等方面發(fā)揮著良好的協(xié)同作用[7]。近年來，中藥及中藥有效成分已成為開發(fā)新型抗肝癌藥物的重要來源[8]。蒼術(shù)酮(Atractylone)是一種從蒼術(shù)(Atractylodeslancea)和北蒼術(shù)(Atractylodeschinensis)中分離出來的倍半萜類成分，現(xiàn)代藥理表明蒼術(shù)酮具有多種藥理活性，如改善潰瘍病灶血液循環(huán)、利尿、抗炎、抗腫瘤、保肝、降血糖、抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等作用[9-10]。本實驗探討蒼術(shù)酮對肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的作用及其作用機制，為蒼術(shù)酮的進一步開發(fā)利用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞株 肝癌HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，目錄號為SCSP-510，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所負(fù)責(zé)傳代，培養(yǎng)。

1.1.2 藥物 蒼術(shù)飲片購自上海華東藥業(yè)公司，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)鑒定，標(biāo)本(編號y20141022)存放于浙江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系。

1.1.3 試劑 胎牛血清(FBS，美國Gibco公司，批號10437-028)；二甲基亞楓溶液(DMSO，上海源葉生物科技公司，批號20170204)；高糖培養(yǎng)基(DMEM)，青霉素-鏈霉素溶液(美國Hyclone公司，批號分別為SH3002201，sv30010)；RIPA裂解液，胰酶細(xì)胞消化液，BCA蛋白濃度測定試劑盒，SDS-PAGE凝膠(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為P0013B，C0201，P0012，P0012A)；MTT試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號M1020)；Annexin V-FITC凋亡試劑盒(美國BD公司，批號為559763)；B細(xì)胞淋巴瘤因子(Bcl-2)，Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(武漢華美生物工程有限公司，批號分別為CSB-E08853h，CSB-E09344h，CSB-E13911h)；半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3，英國Abcam公司，批號ab13847)。

1.1.4 儀器 多功能酶標(biāo)儀，轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司，型號分別為iMark，1704150)；odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司，型號9120)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，型號51030286)。

1.2 方法

1.2.1 蒼術(shù)酮的制備 采用超臨界二氧化碳萃取法對蒼術(shù)酮進行提取，按照本課題組前期經(jīng)驗進行[11]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HepG2細(xì)胞在含10%FBS和1%雙抗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時，用胰酶消化傳代培養(yǎng)。實驗分為4組：空白對照組，蒼術(shù)酮低劑量組(5 μmol/L)、中劑量組(10 μmol/L)、高劑量組(20 μmol/L)。

1.2.3 MTT法檢測HepG2細(xì)胞活性 將HepG2細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于96孔板中(1×104/孔)，孵育過夜。蒼術(shù)酮用藥組分別加入含有不同濃度的蒼術(shù)酮(5、10、20 μmol/L)的溶液，對照組加入等體積的0.1%DMSO。分別孵育24、48、72 h，孵育結(jié)束后加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在培養(yǎng)箱中孵育4 h。實驗結(jié)束后，吸棄上清液，加入150 μL DMSO，37 ℃條件下震蕩10 min溶解沉淀。使用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞在570 nm處的吸光度(OD值)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞凋亡 將HepG2細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔)，分組培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。根據(jù)Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明書對細(xì)胞進行染色，并通過流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞線粒體膜電位 將HepG2細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔)，培養(yǎng)箱中孵育過夜。待細(xì)胞貼壁后分組培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，使用PBS洗滌2次。加入1 mL Rhodamine 123(5 μg/mL)溶液，培養(yǎng)箱中孵育30 min，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位。

1.2.6 DCFH-DA法檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平 將HepG2細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔),待細(xì)胞貼壁后分組培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后，使用PBS洗滌2次，更換DCFH-DA培養(yǎng)基，按照ROS試劑盒說明書進行后續(xù)操作，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強度。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax及Cleaved caspase-3的表達(dá) 將HepG2細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔)，在培養(yǎng)箱中孵育過夜。吸棄舊液，分組培養(yǎng)48 h，PBS洗滌細(xì)胞2次，使用含有PMSF的RIPA裂解液提取細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，收集的細(xì)胞在4 ℃下以1000g離心25 min。BCA試劑盒測定細(xì)胞蛋白濃度，SDS-PAGE電泳和抗體孵育，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色使蛋白質(zhì)條帶可視化，獲取Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3和GAPDH[12]的條帶圖片，并在Image J系統(tǒng)6.0版本下進行定量分析。

1.2.8 Transwell實驗檢測蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響 取對數(shù)期生長的HepG2細(xì)胞給予不同濃度的蒼術(shù)酮分組培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，離心，將HepG2細(xì)胞懸液按200 μL/室(5×104/孔)加入Transwell小室的上室，同時將500 μL含10%FBS的培養(yǎng)基加入到下室，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。吸棄培養(yǎng)基，并棄去上室未遷移的細(xì)胞，用預(yù)冷的95%乙醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機選擇5個視野計數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞增殖抑制的影響 蒼術(shù)酮處理肝癌HepG2細(xì)胞24、48、72 h后，MTT法檢測HepG2細(xì)胞活性。在蒼術(shù)酮處理細(xì)胞24、48 h后，與對照組同一時間相比，蒼術(shù)酮低、中、高劑量組的細(xì)胞活性呈下降趨勢，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(圖1)。此外，蒼術(shù)酮處理HepG2細(xì)胞72 h的半數(shù)抑制率(IC50值)為26.19 μmol/L(圖1)。

2.2 蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞凋亡的影響 對照組和蒼術(shù)酮低、中、高劑量組的細(xì)胞凋亡率分別為0.32%、14.34%、29.32%和50.12%，HepG2細(xì)胞凋亡率隨著蒼術(shù)酮藥物濃度的增加而升高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；中、高劑量組細(xì)胞的凋亡率，與低劑量組比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(圖2)。

圖2 蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞線粒體膜電位丟失的影響 如圖3所示，對照組有5.65%的細(xì)胞丟失膜電位，蒼術(shù)酮低、中、高劑量組分別有10.5%、16.5%和19.2%的細(xì)胞損失線粒體膜電位，4組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注:a,對照組；b，5 μmol/L組；c,10 μmol/L組；d,20 μmol/L組。

2.4 蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響 如圖4所示，對照組HepG2細(xì)胞中ROS的熒光強度較低，經(jīng)不同濃度的蒼術(shù)酮處理后，與對照組比較，蒼術(shù)酮低、中、高劑量組HepG2細(xì)胞中ROS的熒光強度明顯升高(P值均<0.05)。

注:a,對照組；b，5 μmol/L組；c,10 μmol/L組；d,20 μmol/L組，e，蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平定量分析。

2.5 蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞遷移的影響 如圖5和表1所示，在對照組中，大量的HepG2細(xì)胞從上室遷移到下室，在蒼術(shù)酮處理HepG2細(xì)胞48 h后，隨著蒼術(shù)酮藥物濃度的增加，對HepG2細(xì)胞遷移抑制效應(yīng)也逐漸增加。與對照組比較，蒼術(shù)酮低、中、高劑量組的細(xì)胞遷移數(shù)量明顯降低(P值均<0.05)；中、高劑量組的細(xì)胞遷移數(shù)量明顯低于低劑量組(P值均<0.05)。

表1 蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞遷移的影響

注:a,對照組；b，5 μmol/L組；c,10 μmol/L組；d,20 μmol/L組。

2.6 蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞Bcl-2，Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，與對照組比較，蒼術(shù)酮低、中、高劑量組能顯著抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，促進凋亡因子Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。對照組和蒼術(shù)酮用藥組的Bax/Bcl-2蛋白的比率分別為0.20、0.31、1.60、3.78。

圖6 蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞中Bcl-2，Bax和Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

古代文獻(xiàn)并無“肝癌”病名，根據(jù)該疾病的典型特征和臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)“癥瘕”“脅脹”“肝積”“伏梁”“黃疸”“肝著”“積聚”等[7]。蒼術(shù)是多年生菊科植物蒼術(shù)的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目等功效，常用于治療濕阻中焦、脘腹脹滿、泄瀉、水腫、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)寒感冒、夜盲、眼干澀等病癥[13]，有研究[14]報道蒼術(shù)對肺癌、胃癌、食管癌、膽管癌、肝癌等有抑制作用，表現(xiàn)出抗腫瘤的藥理活性。蒼術(shù)酮是從蒼術(shù)中分離出來的倍半萜類化合物，是中藥蒼術(shù)的有效成分之一，周域等[15]研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)酮能與維甲酸β受體緊密結(jié)合，產(chǎn)生維甲酸樣抗腫瘤作用。耿煒等[16]研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)酮能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29細(xì)胞的增殖，并促進細(xì)胞凋亡，有抗結(jié)直腸癌的作用。本研究主要探討蒼術(shù)酮對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡和遷移的作用和其可能作用機制，為蒼術(shù)酮應(yīng)用與肝癌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序性死亡，是由外界刺激因素誘發(fā)后，經(jīng)一系列基因活化及調(diào)控細(xì)胞有序的、自主的主動死亡過程[17]，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)以及對抗有害和潛在危險細(xì)胞的防御機制中發(fā)揮著重要作用，線粒體信號通路在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著較為重要的作用[18]。線粒體損傷的特征是線粒體膜電位的丟失使膜通透性增加，線粒體中細(xì)胞凋亡因子如細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中形成凋亡復(fù)合物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。此外，ROS可促進細(xì)胞色素C從線粒體上解離，因此ROS水平升高可進一步介導(dǎo)線粒體途徑細(xì)胞凋亡[20]。本研究表明蒼術(shù)酮可顯著促進肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)線粒體膜電位的丟失，增加肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進一步促進線粒體膜通透性增加和線粒體膜電位的丟失。

研究[21]表明，在眾多的凋亡相關(guān)基因中，Bcl-2基因家族在凋亡過程中起重要調(diào)節(jié)作用，它可以在細(xì)胞周期的任何階段直接抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞存活周期并誘發(fā)細(xì)胞癌變[22]。在正常狀態(tài)下，Bax存在于細(xì)胞質(zhì)中并與Bcl-2結(jié)合形成異二聚體，從而使促凋亡蛋白穩(wěn)定于細(xì)胞質(zhì)中，并抑制細(xì)胞凋亡[23]。Bax/Bcl-2的比率是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用強弱的關(guān)鍵因素[24-25]，若Bcl-2蛋白的含量相對下降，Bax將移位于線粒體膜上，刺激線粒體釋放促凋亡因子，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。Caspase-3是caspase家族中參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶之一，并位于細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路的中心位置，Cleaved caspase-3是裂解后的caspase-3，是誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵因子，是反映細(xì)胞凋亡可靠的指標(biāo)[27-28]。本研究表明蒼術(shù)酮顯著增加促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。這些結(jié)果表明，蒼術(shù)酮可能是通過降低線粒體膜電位，增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明蒼術(shù)酮對HepG2細(xì)胞具有體外其抑制活性、遷移的作用，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果為后續(xù)蒼術(shù)酮在體內(nèi)對肝癌活性的研究和進一步研究其抑制腫瘤遷移的作用機制提供實驗基礎(chǔ)，并為蒼術(shù)酮治療肝癌的臨床應(yīng)用提供參考。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊雪麗、薛建華、陳天陽負(fù)責(zé)課題設(shè)計，實驗操作及撰寫論文；平鍵、侯天祿負(fù)責(zé)課題設(shè)計，擬定寫作思路，修改論文；陳建杰、成揚指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。