等熱量低碳高蛋白飲食結合有氧運動干預非酒精性脂肪性肝病的血清代謝組學分析

李美鶯，紀萬里，劉王振祖，汪 濤，杜晟楠，高靜靜，蔣元燁，胡 誠

1 上海市普陀區中心醫院 a.健康管理中心，b.消化內科，上海 200062；2 上海健康醫學院 藥學院，上海 201318；3 上海中醫藥大學 a.中藥學院，b.科技實驗中心，上海 201203

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是目前臨床最常見的慢性肝病，其與胰島素抵抗和遺傳引發的代謝應激性損傷密切相關，包括非酒精性單純性肝脂肪病變、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝細胞癌[1-2]。隨著人們飲食和活動方式的改變，患病率呈逐年上升趨勢，給人們的健康和生命安全帶來了巨大威脅，是導致全球衛生問題和經濟負擔的重要因素[3]。目前對于NAFLD的治療尚無相關的特效藥物治療，更多的是通過合理的飲食和運動進行早期干預以改善NAFLD的癥狀[4-6]。改變不良生活方式、減少體質量和腰圍是預防和治療NAFLD及其并發癥最為重要的治療措施。因此，相比于藥物治療，筆者認為碳水化合物限制飲食及適當運動是廣泛推薦的干預措施，適用于大多數NAFLD患者。

越來越多的研究[7-9]表明NAFLD與代謝功能紊亂密切相關，缺乏敏感而靶向的臨床診斷生物標志物給NAFLD的臨床診治，尤其是早期診斷及隨訪策略的制訂帶來了一定的挑戰。隨著現代分析技術的發展，包括代謝組學在內的各種測序技術業已廣泛應用于研究NAFLD的發病機制。代謝組學通過對樣本進行高通量測序，可以發現代謝產物、代謝途徑和規律[10-11]。本文以NAFLD患者為研究對象，收集等熱量低碳高蛋白飲食結合有氧運動干預前后的血清，采用超高效液相色譜串聯高分辨質譜(UPLC-Q-Orbitrap/MS)進行血清代謝組學研究，以探求干預前后的血清生物標志物與代謝途徑的差異，為指導臨床醫生為NAFLD患者制訂合理的飲食及運動策略提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月—2020年1月在上海市普陀區中心醫院消化科及住院部診斷為NAFLD的患者23例，另外選擇13例體檢確定為身體健康的志愿者作為健康對照組，基本資料包括姓名、性別、年齡、住院號/門診號、身高、體質量、腰圍、臨床診斷、現病史、既往史、輸血史、家族史等。參照2010年中華醫學會《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[12]，NAFLD診斷需符合以下三項：(1)無飲酒史或飲酒折合乙醇量男性<210 g/周，女性<70 g/周；(2)除外病毒性肝炎、藥物性肝病、全胃腸外營養、肝豆狀核變性、自身免疫性肝病等可導致脂肪肝的特定疾病；(3)肝活檢組織學改變符合脂肪性肝病的病理學診斷標準。NAFLD定義為：(1)肝臟影像學的表現符合彌漫性脂肪肝的診斷標準且無其他原因；(2)有代謝綜合征相關表現的患者出現不明原因的血清ALT、AST或GGT持續增高半年以上。減肥和改善胰島素抵抗后，異常酶譜和影像學脂肪肝改善甚至恢復正常者符合NAFLD診斷標準。

1.2 納入和排除標準

1.2.1 納入標準 (1)年齡16～75周歲；(2)每周酒精攝入男性不超過210 g，女性不超過70 g；(3)B超或CT檢查存在脂肪肝的影像學改變；(4)排除病毒性肝炎、藥物性肝病、自身免疫性肝病及其他自身免疫性疾病、甲狀腺疾病等其他導致脂肪肝的情況；(5)既往無重大胃腸道手術史，如胃大部切除及胃腸吻合術、結腸癌根治術、小腸切除術等，闌尾切除術、消化性潰瘍穿孔修補術等除外；(6)無嚴重心、肺、腦、腎疾病及惡性腫瘤；(7)女性排除妊娠或近期有受孕意愿者。

1.2.2 排除標準 (1)合并有肝外纖維化疾病包括系統性紅斑狼瘡、風濕類疾病、腎衰竭、慢性阻塞性肺疾病、腫瘤類疾病、糖尿病等；(2)排除合并甲、乙、丙、丁、戊型病毒性肝炎感染；酒精性肝病、自身免疫性肝病、膽汁淤積性肝病、藥物性肝損傷、遺傳代謝性肝病以及晚期肝硬化合并肝臟腫瘤者；(3)正在進行或既往接受過抗肝纖維化治療或抗病毒治療者，服用過降酶藥物者；(4)有黃疸、ALT或AST超過正常值上限2倍及以上；(5)與本研究相關的臨床資料數據不完整的患者。

1.3 研究方法

1.3.1 儀器和試劑 乙腈和甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，購自Thermo Fisher Scientific。超高效液相串聯高分辨質譜(UPLC-Q-Orbitrap/MS, Thermo)；超高效液相串聯三重四級桿質譜(UPLC-MS/MS, AB SCIEX)；超高效液相儀(H-Class, Waters)；1730R冷凍高速離心機(德國GENE有限公司)；TARGINTMVX-Ⅱ多管漩渦振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；Milli-Q純水機[默瑞(上海)生物科技有限公司]；FA2004N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

1.3.2 生活方式干預 劇烈強度運動指運動時心率為最大心率(HRmax)的60%～80%, 運動時心率為HRmax的45%～55%為中等強度運動。故本研究選用中等強度運動，HRmax計算公式為:HRmax=220-年齡(歲)，根據HRmax計算出每個患者運動時的目標心率。選擇的有氧運動干預具體方法為：每周運動3次(每周一、三、五，可根據患者自身情況略微調整)，每次運動時間為50 min，每周共為150 min。首先為10 min熱身運動，包括肢體拉伸和慢走；然后為持續40 min的跑步，保證目標心率維持30 min。本課題組有專門負責指導入組患者有氧運動的醫生，保證每周至少1次隨訪患者，并記錄相關數據。

根據基礎代謝率估算每個受試者的能量需求(使用Harris Benedict方程)，乘以相應于受試者活動水平的1.5。研究飲食提供了來自碳水化合物的大約4%的能量，來自脂肪的72%的能量和蛋白質的24%的能量，飲食中的碳水化合物含量限制在23～30 g/d，記錄基線飲食的常量營養素含量。

因此，本研究設定運動時間為4周，從而避免體質量的減輕對試驗產生干擾。所有入組患者進行運動飲食干預，均在入組時及4周后檢測體質量、腰圍、肝功能、血脂、血糖。

1.3.3 剔除標準 (1)有氧運動組患者1周內無3次有氧運動者；(2)等熱量低碳高蛋白飲食組患者隨意進食者；(3)無任何有氧運動組患者連續2天進行有氧運動者；(4)試驗過程中出現不能耐受有氧運動者。

1.3.4 代謝組學研究

1.3.4.1 血清處理 采集健康志愿者和脂肪肝患者經運動飲食干預前后清晨空腹靜脈血10 mL，4 ℃靜置2 h后3000 r/min離心15 min，吸取上清液，于-80 ℃冰箱凍存。取解凍后的血清樣品100 μL加入400 μl 甲醇，渦旋振搖1 min充分提取后，在4 ℃條件下以12 000 r/min 離心10 min，將上清轉入進樣小瓶待測。

1.3.4.2 色譜條件 色譜柱：C18色譜柱(Hypergod C18，100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流速0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；流動相組成為A：純水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.4.3 質譜條件 正離子模式：加熱器溫度300 ℃；鞘氣流速：45 psi；輔助氣流速：5 L/min；尾氣流速：0.3 L/min；電噴霧電壓：3.0 kV；毛細管溫度：350 ℃；S-Lens RF Level，30 %。負離子模式：加熱器溫度300 ℃；鞘氣流速：45 psi；輔助氣流速：5 L/min；尾氣流速：0.3 L/min；電噴霧電壓：3.2 kV；毛細管溫度：350 ℃；S-Lens RF Level，60 %。

1.4 倫理學審查 本研究方案經由普陀區中心醫院倫理委員會審批，批號：PTEC-A-2018-49-1。所納入患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 基本資料分析 健康對照組的BMI及體質量明顯低于干預前NAFLD組患者(P值均<0.05)，兩組間腰圍差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。NAFLD患者經生活方式干預后，BMI、體質量及腰圍下降不顯著(表3)。

2.2 血清生化指標分析 檢測各組血清生化指標發現，健康對照組Alb、GGT、ALT、GLU表達水平明顯低于干預前NAFLD患者(P值均<0.05)(表2)。經生活方式干預后，NAFLD患者Alb、GGT、ALT表達水平較干預前降低(P值均<0.05)，ChE、AST、GLU水平差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表3)。

2.3 血脂水平分析 血脂水平檢測分析發現，健康對照組TC、TG表達水平明顯低于干預前NAFLD患者(P值均<0.05)(表2)。經生活方式干預后，NAFLD患者的血清中TG、TC水平均較干預前降低(P值均<0.05)，HDL-C、LDL-C改善不顯著(P值均>0.05)(表3)。

表2 2組基線資料及血清生化參數比較

表3 NAFLD組干預前后臨床資料及血清生化參數比較

2.4 血清代謝物差異分析 運用SIMCA14.0軟件對健康對照組、NAFLD生活方式干預前及干預后的血清代謝物進行PCA分析，結果發現健康對照組和NAFLD生活方式干預前后組的代謝表型有較好的區分，NAFLD患者經生活方式干預前后代謝產物顯示出明顯差異性(圖1)。進一步采用OPLS-DA評分發現同NAFLD生活方式干預前相比，干預后血清代謝物出現明顯分離，表明兩組代謝產物差異明顯(圖2)，說明這些代謝產物有可能是NAFLD生活方式干預的靶向代謝產物。

圖1 健康對照組及NAFLD患者運動飲食干預前后的PCA

圖2 NAFLD患者運動飲食干預前后的OPLS-DA

2.5 生物標志物熱圖分析 將OPLS-DA模型中VIP值>1的血清生物標志物進行統計分析，并結合t檢驗(P<0.05)為靶標篩選依據對NAFLD生活方式干預前后的生物標志物靶標進行篩選。結果發現33種代謝物發生了顯著變化(圖3)，其中包括Oleoyl-L-α-lysophosphatidic acid, Stearic acid，Sulcatone，Oleamide，Linoleic acid等與膽汁酸代謝相關的代謝產物和磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、鞘磷脂等與脂質相關代謝產物。

圖3 NAFLD患者經運動飲食干預前后的差異代謝物熱圖

2.6 差異代謝產物通路富集分析 利用KEGG通路分析NAFLD生活方式干預前后的血清差異代謝物所富集的通路，結果發現這些差異代謝途徑富集于不飽和脂肪酸、膽汁酸合成和苯丙氨酸代謝等(圖4)。

圖4 差異代謝產物通路富集分析

3 討論

眾所周知，肥胖、富含飽和脂肪和果糖的高熱量膳食結構，以及久坐少動的生活方式是NAFLD的高危因素。大量文獻[13-15]報道，對于超重、肥胖，以及近期體質量增加和“隱性肥胖”的NAFLD患者，建議通過健康飲食和加強鍛煉的生活方式糾正不良行為。本研究發現，經過4周的生活方式干預，NAFLD患者體質量、BMI、ALP、Alb、GGT、ALT、TG都有較大幅度的降低，這與目前的文獻報道一致。

隨著高通量測序工具-代謝組學已應用于臨床疾病的診斷和機制研究中，其已成為中醫藥領域研究的重要工具，可實現對機體內代謝產物進行快速鑒定分析、尋找差異的生物代謝途徑，從而發現疾病的診斷標志物和藥物治療干預的靶向代謝產物[16-17]。近年來，研究[18]表明膽汁酸代謝在肝臟代謝性疾病的發生發展中有著越來越重要的作用，成為診斷肝功能及肝臟疾病的一類敏感的標志物。膽汁酸具有調控膽固醇代謝、促進脂類代謝、增加膽汁分泌等多種作用，是膽固醇代謝過程中的主要代謝產物[19]。初級膽汁酸是肝細胞以膽固醇為原料直接合成的，其從肝內被分泌出來后進入腸腔，在一些酶和細菌的代謝下成為次級膽汁酸[18]。牛磺膽酸是疏水性膽汁酸，亦是初級膽汁酸。有研究[19]表明，肝病患者中的牛磺膽酸水平顯著升高，是肝硬化患者中改變最明顯的膽汁酸。本研究發現，對NAFLD進行生活方式干預后，與膽汁酸代謝信號通路相關的代謝物出現了顯著性改變，提示這些差異的膽汁酸代謝物參與了NAFLD發病過程，生活方式干預后可明顯改善膽汁酸代謝紊亂的過程。

肝臟還是氨基酸代謝的主要器官，當肝臟受損時，血液中的氨基酸水平會發生顯著變化。本研究發現NAFLD患者血清中酪氨酸水平降低，苯丙氨酸水平顯著升高，而經生活方式干預后緩解。這可能是由于運動飲食激活了苯丙氨酸羥化酶的活性，使苯丙氨酸可以順利轉化為酪氨酸，而后者具有清除自由基[20]和減輕炎癥的作用[21]。

本研究還發現生活方式干預前后不飽和脂肪酸水平有顯著變化，特別是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)水平在干預后顯著降低。AA是一種多不飽和脂肪酸，在血液、肝臟等器官中起重要作用。此外，AA還是前列腺素E2、前列腺環素和白細胞三烯的直接前體。這些物質對機體的炎癥具有重要的調節作用。有文獻[22-23]表明過多的AA堆積會產生大量炎癥因子，進一步誘導肝損傷。

本研究還存在著一定的不足之處，比如生活方式干預的時間較短，只有1個月的干預時間，對于有些患病較久的患者而言可能效果并不是非常顯著，且由于研究條件的限制，無法百分百監測納入者有無額外攝入食物，也無法全程監測患者的運動方式是否百分百達標，但是，筆者發現生活方式干預后可以不同程度的改善患者的體質量、肝功能以及血脂，并通過代謝組學更加深入的表明生活方式的干預對患者的代謝起到干預作用，也進一步證實了控制飲食、適當合理的運動對NAFLD患者的重要性和必要性。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：蔣元燁、胡誠負責課題設計；李美鶯負責撰寫論文；李美鶯、汪濤、杜晟楠、高靜靜參與收集數據；紀萬里、劉王振祖負責資料分析；蔣元燁、胡誠負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。