肝臟TM6SF2特異性敲除促進非酒精性脂肪性肝病小鼠肝臟脂肪變性

張 杰，馬學峰，王藝奮，王孟軻，莊立琨，劉守勝，辛永寧,3

1 青島大學附屬青島市市立醫院 感染性疾病科，山東 青島 266011；2 青島大學附屬青島市市立醫院臨床研究中心，山東 青島 266071；3 青島市消化疾病重點實驗室，山東 青島 266071

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種以肝細胞內脂質過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征[1-2]，目前已成為全球范圍內發病率最高的慢性肝臟疾病[3]。系統研究NAFLD的發病機制對于其防治至關重要。NAFLD是一種由遺傳、飲食和腸道微生態等多種因素共同作用的復雜疾病[4-5]，近年來遺傳因素在NAFLD發病中的作用引起越來越多重視。Kozlitina等[6]發表的一項外顯子組關聯研究發現，跨膜蛋白超家族6成員2基因(transmembrane 6 superfamily member 2，TM6SF2)編碼蛋白的E167K多態性在NAFLD發生發展過程中起重要作用。TM6SF2屬于跨膜蛋白超家族成員，主要在肝臟、小腸、腎臟等器官高表達。隨后的人群試驗[7-9]也進一步證實TM6SF2 E167K多態性是NAFLD的一個致病風險因子。

本研究構建了TM6SF2肝細胞特異性敲除(TM6SF2-HKO)小鼠模型，發現在高脂飲食條件下，TM6SF2-HKO小鼠的肝質量、肝指數、ALT、胰島素水平及肝臟TG水平均高于對照組小鼠，證明了肝細胞敲除TM6SF2可加重高脂飲食誘導的肝臟脂肪變性和肝損傷，為研究TM6SF2在NAFLD中的長期作用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 肝組織特異表達Cre重組酶轉基因(Alb-Cre)小鼠由張令強教授(北京軍事醫學研究院)贈送。8周齡雄性TM6SF2-HKO小鼠和對照小鼠(TM6SF2-Flox)(各4只/組)給予高脂飲食(60%脂肪)16周建立NAFLD模型，TM6SF2-HKO小鼠和TM6SF2-Flox小鼠(各8只/組)給予普通飲食16周作為對照。所有小鼠維持12 h明/暗周期并自由攝入食物和飲用水。建模完成，小鼠禁食6 h后給予安樂死。

1.2 嵌合體F0代陽性小鼠的獲得 通過CRISPR/Cas9系統構建TM6SF2基因條件性敲除小鼠模型。構建針對小鼠TM6SF2基因的sgRNA、Cas9 mRNA和攜帶LoxP片段的donor載體。利用TM6SF2特異性sgRNA指導Cas9核酸酶在內含子2和內含子3中剪切DNA雙鏈，通過同源重組修復將LoxP序列整合到兩位點。將sgRNA、Cas9 mRNA和donor載體共同注入雌鼠受精卵中，將受精卵植入到假孕的小鼠子宮中。所得子代通過PCR鑒定基因型，挑選出F0代陽性小鼠。雄性F0代小鼠與野生雌鼠交配，獲得F1代嵌合體小鼠。

1.3 小鼠基因型鑒定的方法 剪取小鼠尾尖于離心管中，加入70 μl裂解液A液(25 mmol/L NaOH，20 μmol/L EDTA)，95 ℃金屬浴45 min后，加入70 μl的裂解液B液(40 mmol/L Tris-Cl)，充分研磨組織，離心所得上清液即為基因組DNA，以該DNA為模板進行PCR擴增，引物序列見表1。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據條帶判斷其基因型。

表1 基因型鑒定對應的引物序列

1.4 RNA提取和定量(q)RT-PCR分析 使用RNAiso(Takara，日本)從各組織中提取總RNA，使用PrimeScriptTM試劑盒(Takara，日本)將RNA逆轉錄成cDNA，利用SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen，德國)以β-Actin為內參定量TM6SF2基因在各組織的表達量。用到以下引物，TM6SF2：5′-CGGACTGGGCCTTGGTATTT-3′，5′-CTTGGTCCTGTGGCGAAGAT-3′；β-Actin：5′-CAGCTTCTTTGCAGCTCCTT-3′，5′-CACGATGGAGGGAATACAG-3′。

1.5 口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT) 小鼠禁食6 h后，測量小鼠尾靜脈血糖。按照2 mg/kg的劑量給予小鼠灌胃葡萄糖[10]，記錄小鼠灌胃后30 min、60 min和120 min時間點的血糖值。

1.6 小鼠血液相關指標檢測 小鼠禁食后，按照0.01 mL/g的劑量腹腔注射4%水合氯醛，麻醉后取其靜脈血，根據試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)所述方法檢測血漿中AST、ALT、TG、TC及胰島素水平。

1.7 小鼠肝臟TG檢測 稱量10 mg小鼠肝組織，加入90 μL無水乙醇，充分研磨組織，離心后取上清液，使用TG檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)檢測肝臟TG水平。

1.8 倫理學審查 所有動物實驗均按照青島大學附屬醫院醫學實驗動物倫理委員會批準的指導原則進行。實驗動物生產許可證：SCXK(蘇)2018-0008，實驗動物使用許可證：SYXK(魯)2020 0009，倫理審批編號：AHQU-MAL20180504。

2 結果

2.1 TM6SF2-HKO小鼠的獲得與鑒定 為探究TM6SF2在NAFLD發生發展中的作用，使用CRISPR/Cas9系統構建了TM6SF2條件性敲除小鼠，構建策略如圖1所示。按Cre/LoxP繁殖策略，獲得的子代小鼠通過PCR鑒定其基因型(圖2)。提取TM6SF2-HKO小鼠和TM6SF2-Flox小鼠肝臟以及心、腎、小腸等組織RNA，發現除肝臟外(t=5.823,P=0.028)，其他組織TM6SF2表達水平差異均無統計學意義(P值均>0.05)，證明在TM6SF2-HKO 小鼠中，TM6SF2在肝細胞特異性敲除(圖3)。

圖1 TM6SF2-CKO小鼠構建策略

注：a,TM6SF2fl/fl鑒定,電泳僅有一條332 bp條帶，則為TM6SF2fl/fl純合小鼠；僅有一條239 bp條帶，則為TM6SF2-/-野生小鼠；若兩條帶都存在，則為TM6SF2fl/-雜合小鼠。b,Alb-Cre鑒定，若有一條279 bp條帶，則為Cre轉基小鼠。因此，42號為TM6SF2-HKO小鼠(TM6SF2fl/fl Alb-Cre)，45號為TM6SF2-Flox小鼠(TM6SF2fl/fl)。

圖3 TM6SF2-HKO和TM6SF2-Flox小鼠各組織TM6SF2表達水平

2.2 高脂飲食下TM6SF2-HKO可增加小鼠肝指數及ALT水平 TM6SF2-HKO小鼠構建成功后，給予兩組小鼠高脂飲食以探究其一般情況差異。結果發現普通飲食及高脂飲食下，TM6SF2-HKO和TM6SF2-Flox小鼠體質量差異無統計學意義(P值均>0.05)。高脂飲食時，TM6SF2-HKO組小鼠肝質量、肝指數高于TM6SF2-Flox組(P值均<0.01)，而普通飲食時差異均無統計學意義(P值均>0.05)。檢測血漿中與肝損傷相關的ALT和AST水平，發現給予高脂飲食時，TM6SF2-HKO組血漿ALT水平較TM6SF2-Flox組升高(P<0.01)，AST水平差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 TM6SF2-HKO對小鼠肝質量、肝酶等指標影響

2.3 TM6SF2-HKO促進血漿胰島素水平升高 肝臟對于調節葡萄糖穩態起重要作用，檢測糖代謝相關指標，發現在普通飲食和高脂飲食的條件下，TM6SF2-HKO和TM6SF2-Flox組空腹血糖無差異(P值均>0.05)，TM6SF2-HKO組血漿胰島素水平較TM6SF2-Flox組升高(P值均<0.05)。給予小鼠灌胃葡萄糖，發現在30、60和120 min時，兩組小鼠血糖及OGTT對應曲線下面積差異均無統計學意義(P值均>0.05)，胰島素抵抗指數差異也無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 肝細胞TM6SF2缺失對小鼠糖代謝影響

2.4 高脂飲食下TM6SF2-HKO可加重肝臟脂肪變性 進一步檢測脂代謝相關指標，發現在普通飲食和高脂飲食條件下，TM6SF2-HKO組和TM6SF2-Flox組之間血漿TC、TG水平差異均無統計學意義(P值均>0.05)。高脂飲食時，TM6SF2-HKO小鼠肝組織TG水平高于TM6SF2-Flox小鼠(P<0.05)(表4)。HE染色發現TM6SF2-HKO組脂滴數量和大小高于TM6SF2-Flox組(圖4)。油紅O染色結果表明，高脂飲食增加了肝臟紅染面積，TM6SF2-HKO組紅染面積高于TM6SF2-Flox組(圖5)。

注：a，TM6SF2-Flox-CD；b，TM6SF2-HKO-CD；c，TM6SF2-Flox-HFD；d，TM6SF2-HKO-HFD。

注：a，TM6SF2-Flox-CD；b，TM6SF2-HKO-CD；c，TM6SF2-Flox-HFD；d，TM6SF2-HKO-HFD。

表4 TM6SF2-HKO對小鼠脂代謝影響

3 討論

全身敲除小鼠模型可導致全部體細胞內靶基因缺失，可能存在胚胎發育異常、純合致死等問題，而條件性敲除小鼠模型可以特異性敲除某個特定組織或器官中的靶基因，以研究該基因在特定組織或器官中的作用[11]。Fan等[12]通過TM6SF2全身敲除的小鼠模型、肝臟特異性過表達人源TM6SF2基因的小鼠模型，Kozlitina等[6]利用腺病毒特異性敲低肝細胞TM6SF2的小鼠模型探究TM6SF2在NAFLD中的作用，但其在肝臟的生理功能并未達成共識。CRISPR/Cas9技術具有簡單、快速、高效的優勢，逐漸成為靶向基因組編輯的主要工具[13]，被應用于動物模型的構建等方面[14]。本研究利用CRISPR/Cas9技術構建了穩定的TM6SF2-HKO小鼠模型，以研究肝臟TM6SF2在NAFLD發生發展中的作用。

血清ALT、AST水平升高被認為是判斷急性肝損傷嚴重程度的重要指標[15-16]。本研究中高脂飲食條件下，TM6SF2-HKO小鼠血漿ALT水平高于TM6SF2-Flox小鼠，表明敲除肝臟TM6SF2在高脂喂養時可加重小鼠肝損傷。血漿AST水平無差異，可能是由于ALT反映早期肝細胞損傷，而AST反映較嚴重肝細胞損傷[15,17]，肝臟病理學同樣證明在高脂飲食條件下，TM6SF2-HKO加重了肝細胞損傷程度。肝臟產生的葡萄糖約占內源性葡萄糖產量的90%，這對葡萄糖穩態的調節至關重要[18]，NAFLD與胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關[19]。檢測肝臟TM6SF2對糖代謝的影響，發現在普通飲食和高脂飲食下，TM6SF2-HKO小鼠胰島素水平較對照組升高，并可能導致了本研究觀察到的其血糖水平稍低于對照組，提示肝臟敲除TM6SF2后可能通過改變胰島素水平進而調節糖代謝。

NAFLD以肝細胞內脂質過度沉積為主要特征，可導致肝質量、肝指數等指標改變。本研究中喂養TM6SF2-HKO小鼠高脂飲食16周，小鼠肝質量、肝指數和肝臟TG水平均較對照組升高，表明肝臟特異性敲除TM6SF2可促進高脂飲食誘導的肝臟脂肪變性，TM6SF2的表達水平是代謝穩態的一個重要決定因素。已發表的TM6SF2全身敲除小鼠模型中，高脂飲食喂養12周后小鼠肝指數無變化[12]，推測可能是由于本研究為肝細胞特異性敲除或全身敲除模型中高脂喂養僅12周而脂肪變性程度低所致。本研究中TM6SF2-HKO小鼠血漿TC水平較對照組無差異，而全身敲除小鼠的血漿TC水平較對照組下降[9]。可能是由于TM6SF2不僅在肝臟中高表達，在小腸中也高表達，小腸參與了部分TC合成過程，導致TM6SF2-HKO模型和全身敲除模型結果不一致。本研究還發現，在高脂飲食條件下，兩組小鼠血漿TG水平降低，但無統計學差異，肝臟中TG水平升高。這與腺相關病毒敲低肝臟TM6SF2小鼠表型基本一致[6]。根據肝臟敲除TM6SF2對TG的影響，筆者推測肝臟敲除TM6SF2可能導致血漿TG更多的轉化為肝臟TG，進而導致肝臟脂質蓄積增加。相較CRISPR/Cas9系統和Cre/LoxP策略，腺相關病毒敲低基因雖耗時較短，但敲低效果不穩定。相比而言，利用CRISPR/Cas9系統和Cre/LoxP策略特異性敲除肝臟TM6SF2可得到更穩定敲除的小鼠模型。筆者通過肝臟病理診斷發現高脂喂養的小鼠肝臟出現典型的大泡小泡混合性脂肪變，但無明顯的小葉炎癥和氣球樣變性，表明在高脂飲食時肝臟敲除TM6SF2可加重小鼠單純性脂肪變，但并未觀察到相關非酒精性脂肪性肝炎表型。

本研究利用CRISPR/Cas9系統和Cre/LoxP策略構建穩定的TM6SF2-HKO的小鼠模型，并研究其在NAFLD發生發展中的作用。研究發現在高脂飲食條件下，肝細胞TM6SF2缺失可增加小鼠的肝質量、肝指數、ALT水平和肝內TG水平，證明TM6SF2-HKO可加重肝臟脂肪變性和肝損傷程度，進一步證實肝臟TM6SF2在NAFLD發生發展過程中起重要作用。本研究探究了肝臟TM6SF2在NAFLD發生發展過程中的長期作用，為今后進一步研究TM6SF2在NAFLD中的作用奠定基礎。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：張杰進行課題設計與實施、撰寫論文；馬學峰、王藝奮進行課題實施；王孟軻數據收集，參與起草文章；莊立琨、劉守勝進行課題設計，參與修改文章關鍵內容；辛永寧進行課題設計和實驗指導。